外周血CTCs 与前列腺癌临床特征的相关性

李 珲，平秦榕，史云强，王春晖，杨 洋，胡礼炳，毕晓方，李 健，钟一鸣

（昆明市延安医院泌尿外科，云南昆明 650051）

前列腺癌是老年男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居泌尿系肿瘤第1 位，居男性全身恶性肿瘤第2 位[1]。前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）目前临床常用的筛查、监测前列腺癌的血液学指标，但由于PSA 是组织特异性抗原而非肿瘤特异性抗原，故具有一定的假阳性率，尤其对于PSA 值为4～10 ng/mL 的患者，前列腺癌检出率仅为25%左右[2-3]。寻找敏感性高、特异性强、无创、检测成本低、简便易行的前列腺癌筛查、监测的方法已成为研究的热点。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）检测是一种采集外周血，检测外周循环血中肿瘤细胞的数量，进而对肿瘤进行筛查、监测的方法，具有较好的临床应用前景。本研究通过检测前列腺癌患者CTCs 数量，分析CTCs 检测与前列腺癌临床特征的相关性，旨在探讨CTCs 检测在前列腺癌筛查、监测中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 病例资料

回顾性分析2016 年1 月至2018 年12 月期间昆明医科大学附属延安医院泌尿外科收治的110 例前列腺疾病（前列腺增生或前列腺癌）患者的临床资料。按诊断不同分为两组，其中57 例前列腺癌患者作为研究组，所有患者均经B 超引导下穿刺活检或（和）术后病理确诊为前列腺癌，肿瘤均为初次发现，年龄63～79 岁，平均（69.5±7.7）岁；53 例前列腺增生患者作为对照组，术后病检均确诊为前列腺增生，年龄66～81 岁，平均（71.2±5.4）岁。本研究报医院科研部和伦理委员会获得批准，检测前所有患者签署知情同意书。两组年龄差异无统计学意义（t=-1.3313，P=0.0929）。

有以下情况者排除[4-6]：（1）既往有肿瘤病史或合并其他系统肿瘤病史者；（2）合并急慢性前列腺炎者；（3）合并严重的呼吸、循环、血液系统疾病者；（4）检测前3 月内口服抗凝药物、激素类药物或有创伤、手术史者。

1.2 检测方法

医用抗凝采血管（抗凝剂为EDTA·K2/EDTA·Na2）采集患者外周血4～6 mL，4℃冷藏、运送，48 h 内检测。利用免疫磁球分离（Anti-EpCAM）及荧光染色法对外周血中的CTC 进行检测和计数。采血时机均为手术或内分泌治疗、放化疗前。

1.2.1 CTCs 的分离（1）取3.75 mL 抗凝血液，加入等体积的清洗液进行稀释后备用，50 mL 离心管中加入7.5 mL 样本密度分离液，将稀释后的血液小心平铺到分离液液面上方，注意保持两界面的清晰；（2）室温下，低速离心机水平转子2 000 rpm，离心20 min；（3）离心后出现明显的4 层分层，吸弃最上层稀释血浆层，小心取第二层白膜层置于15 mL 离心管中，加入2 mL 清洗液（沪浦械备20160087 号）重悬细胞；（4）加入Anti-EpCAM 免疫纳米磁球30 μL，室温孵育30 min，每5 min 混匀一次；（5）孵育结束后将离心管插入多功能磁分离架上静置15 min，吸弃上清液后将离心管自多功能磁分离架上取出。

1.2.2 细胞固定（1）取400 μL 组织固定液重悬样品，室温放置10 min；（2）向离心管中加入1mL 清洗液，将离心管插入多功能磁分离架上静置15 min，吸弃上清液后将离心管自多功能磁分离架上取出。

1.2.3 细胞染色（1）加30 μL 染色液A（Anti-CK8，18，19-FITC 荧光抗体）、20 μL 染色液B（DAPI）、10 μL 染色液C（Anti-CD45-PE 荧光抗体），混匀后避光染色15 min；（2）向离心管中加入1 mL 清洗液，将离心管插入多功能磁分离架上静置15 min，吸弃上清液后将离心管自多功能磁分离架上取出；（3）向离心管中加入1 mL 清洗液，将离心管插入多功能磁分离架上静置15 min，吸弃上清液后将离心管自多功能磁分离架上取出。

1.2.4 CTCs 的计数 向离心管中加入30 μL 清洗液重悬磁球-细胞混合物，混匀后将溶液均匀涂于防脱载玻片上，Leica DM4 B&DM6 B Life Science Research 自动扫描显微镜和图像分析系统，按照相应程序进行CTCs 计数与统计。

1.2.5 判定标准（1）当细胞核DAPI 染色（蓝色荧光）为阳性，Anti-CK8，18，19-FITC（绿色荧光）为阳性、细胞大小＞8 μm，可判断为循环肿瘤细胞；（2）荧光符合循环肿瘤细胞判断标准，但其大小＜8 μm 时判为阴性；（3）荧光及大小符合上述第1 条要求，但其明显不具有细胞形态时判为阴性；（4）CTCs 阳性标准：外周血中CTCs≥5个/3.75 m 血样。

1.3 观察指标

统计并分析研究组与对照组CTCs 阳性率的差异。根据CTCs 计数结果，将研究组57 例进一步分为CTCs 阳性组和CTCs 阴性组，对比2 组PSA、Gleason 评分、病理分期≥T3a 发生率、骨转移发生率等指标的差异。

1.4 统计学处理

采用SPSS 统计学软件对数据进行统计分析。所有计量资料符合正态分布，以（）表示，2组间比较采用两独立样本t 检验；计数资料以例（%）表示，2 组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究组与对照组CTCs 计数结果比较

免疫磁球分离及荧光染色法处理后可见CD45-、DAPI+、细胞角蛋白19+的CTCs（蓝色荧光为细胞核DAPI 染色阳性；绿色荧光为Anti-CK19-FITC 阳性），见图1。CTCs 计数显示，研究组CTCs 平均数量[（7.4±1.5）个]显著高于对照组[（2.1±0.9）个]，差异具有统计学意义（t=22.2616，P＜0.0001）。研究组CTCs 阳性率61.4%（35/57）显著高于对照组5.7%（3/53），差异具有统计学意义（χ2=35.3157，P＜0.0001）见图1。

图1 CTCs 阳性（CD45-、DAPI+、Anti-CK19-FITC+）Fit.1 CTCs positive（CD45-，DAPI+，Anti-CK19-FITC+）

2.2 CTCs 阳性组与阴性组比较

根据CTCs 计数结果将研究组57 例前列腺癌分为CTCs 阳性组35 例（CTCs≥5 个/3.75 m）和CTCs 阴性组22 例（CTCs＜5 个/3.75 m）。CTCs 阳性组PSA 值[（35.4±15.7）ng/mL]高于CTCs 阴性组[（17.5±10.6）ng/mL]；CTCs 阳性组Gleason 评分[（8.1±1.3）]高于CTCs 阴性组[（7.2±1.1）]；CTCs 阳性组骨转移发生率[34.3%（12/35）]高于CTCs 阴性组[9.1%（2/22）]，差异具有统计学意义（P＜0.05）。CTCs 阳性组的病理分期≥T3a 发生率[29.2%（7/24）]低于CTCs 阴性组[30.3%（10/33）]大于CTCs 阴性组，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 CTCs 阳性组与阴性组比较Tab.1 Comparison of CTCs between positive group and negative group

3 讨论

近年来，随着我国人口老龄化的加剧，以及生活方式和饮食结构的变化，我国前列腺癌的发病率呈快速增长趋势，70 岁以上老年男性的前列腺癌发病率已跃居男性泌尿生殖系肿瘤发病率第1位，对老年男性的健康造成了极大的威胁[4]。由于前列腺癌具有发病隐匿、早期诊断率低的特点，大部分患者就诊时已进展至中晚期，治疗难度大、成本高，严重危害男性的健康。肿瘤标志物的研究给前列腺癌的早期诊断带来了希望，有些检测肿瘤标记物的技术已经用于临床。PSA 是目前唯一公认的可用于前列腺癌筛查、早期诊断的前列腺癌标志物，但易受炎症、射精、直肠指诊和导尿操作的影响，而出现假阳性。

在肿瘤的发生发展过程中，部分肿瘤细胞脱落后进入外周血，随血液循环迁移、侵袭，进而为转移病灶的形成提供了基础。循环肿瘤细胞CTCs 是指从原发性或继发性肿瘤病灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞，与原发肿瘤细胞有类似的抗原和遗传特性[5]。大量研究显示[6]，CTCs 检测具有非侵入性和实时监测的优点，有利于早期发现复发和转移病灶，可用于筛选进展风险较高的患者，以便及早采取针对性治疗。目前对CTCs 的检测分析过程主要包括富集、分选、鉴定和分析等过程，相关技术主要包括免疫磁珠浓集、密度梯度离心、过滤分离、RT－PCR、免疫学方法、流式细胞分析、CTCs 芯片等。

有研究表明，检测前列腺癌CTCs 的技术敏感性有限，但有很高的特异性，并且CTCs 数量与前列腺癌的分级和临床分期显著相关[7]。据文献报道[8-9]，CTCs 计数可作为对已发生转移的前列腺癌患者判断疗效和预后的指标。美国食品药品监督管理局（FDA）已经批准将CTCs 计数作为转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的预后评价指标[10]。但由于外周血中的CTCs 相当稀少，血液中约每106～107个白细可能仅有1 个CTCs[11]。因此，CTCs 的检测需要细胞富集、结合细胞表面及内部标志物的多种技术。此外，由于肿瘤存在异质性，肿瘤细胞的特性和标志物也不尽相同，这就给CTCs 的捕获及标记带来较大的困难。因此，有必要进一步开展CTCs 研究，通过CTCs 检测技术的改进和设备的更新来进一步提高前列腺癌筛查、监测的准确性。

随着近年来分子生物学技术的不断发展，CTCs 富集和检测技术取得突破性进展，CTCs 检测的应用价值逐渐受到关注。本研究采用Cell Identify CTCs 检测试剂盒对前列腺癌CTCs 进行分离、富集、固定、染色和计数，Anti-EpCAM免疫纳米磁球表面的抗体能与前列腺癌患者外周血中的CTCs 表面EpCAM 抗原发生特异性的结合，通过磁分离技术可实现CTCs 的分离和富集。在免疫磁球完成了对CTCs 的分离和富集后，添加荧光试剂以识别并对CTCs 计数。将样本、试剂混合染色后，经荧光显微镜观察进行鉴定，将具有Ep-CAM+、DAPI+、细胞角蛋白8、18 及/19+的细胞归类为前列腺癌CTCs，从而实现对肿瘤患者外周血中的CTCs 的计数。研究结果显示，研究组CTCs 平均数量（7.4±1.5）个显著高于对照组（2.1±0.9）个，研 究 组CTCs 阳 性 率61.4%（35/57）显著高于对照组5.7%（3/53）（P ＜0.05）。表明该方法检测前列腺癌患者CTCs 具有较好的可行性和有效性，CTCs 数量与前列腺癌的发病风险呈正相关性，前列腺癌患者的CTCs 阳性率显著高于良性前列腺增生，CTCs 阳性可作为筛查、监测前列腺癌的一项辅助依据。此外，CTCs 阳性组患者PSA 值[（35.4±15.7）ng/mL 与（17.5±10.6）ng/mL]、Gleason 评 分[（8.1 ±1.3）与（7.2±1.1）]和骨转移发生率[34.3%（12/35）与9.1%（2/22）]均显著高于CTCs 阴性组（P ＜0.05）。表明CTCs 阳性与前列腺癌PSA 值、Gleason 评分和骨转移发生率有明显相关性，在前列腺癌辅助诊断、疗效监测和预后风险评估中具有较好的临床价值。

尽管目前尚无一种检测方法能完全替代PSA联合DRE、病理学活检在前列腺癌筛查和诊断中的作用，但多种检测技术的联合应用有望为前列腺癌的早期诊断、复发和转移监测带来新的突破。CTCs 检测作为一种新型的体液活检技术，具有简便、无创、可靠的优点，可作为一项辅助诊断技术应用于前列腺癌的筛查和病情监测、预后风险评估，具有较好的潜在临床应用价值。