黑皮鸡菌固体培养基及温度优化*

王 皓，刘 迪，2**，李官浩，陈功鑫，于婷婷，金香花

（1.延边大学农学院，吉林 延吉133002；2.延边大学农学院食（药） 用真菌研究所，吉林延吉133002；3.延边大学食品研究中心，吉林延吉133002；4.延边百草药材有限公司，吉林珲春133300）

1 材料与方法

1.1 供试品种

1.2 试验设备

HF-150A型数控电热恒温培养箱，金坛市恒丰仪器厂；GD-2-500型电热鼓风干燥箱，湖北黄石市医疗器械厂；HVA-85高压灭菌器，株式会社平山制作所；JL102N型电子天平，上海精天电子仪器有限公司；YD-C2试验台，辽宁育达科技装备有限公司。

1.3 培养基配方

碳源基本培养基：酵母浸膏2 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、MgSO41 g、琼脂 20 g·L-1；氮源基本培养基：葡萄糖 20 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、MgSO41 g、琼脂20 g·L-1；无机盐基本培养基：葡萄糖20 g·L-1、酵母浸膏 2 g·L-1、琼脂 20 g·L-1。

1.4 单因素试验

1.4.1 碳源的影响

碳源水平设置有乳糖、果糖、甘露醇、淀粉、葡萄糖、麦芽糖以及蔗糖。将碳源基本培养基设为对照组。碳源含量为20 g·L-1，氮源含量为2 g·L-1，无机盐含量为0.5 g·L-1。将大小为0.5 mm左右长势良好的黑皮鸡菌菌块用打孔器接种于平板中央，并于恒温箱中进行暗培养，每组5个重复。在坐标纸上记录菌落日均长势，选择其中长势较好的培养皿，观察其菌落生长速度、菌落长、干重和整齐边缘的特征，菌丝长满后，使用十字交叉法测定菌落直径，做好记录。黑皮鸡菌菌丝日均生长速率按参考文献[16]进行计算。

1.4.2 氮源的影响

氮源水平设置有蛋白胨、酪蛋白胨、氯化铵、硫酸铵、牛肉膏、硝酸铵、酵母浸膏和硝酸钠。将氮源基本培养基设为对照组。碳源的含量为20 g·L-1，氮源的含量为 2 g·L-1，无机盐的含量为 0.5 g·L-1，每组5个重复。

1.4.3 无机盐的影响

无机盐水平设置有硫酸镁、氯化钠、硫酸钾、硫酸锰、碳酸钙以及硫酸锌。将无机盐基本培养基设为对照组。碳源的含量为20 g·L-1，氮源的含量为2 g·L-1，无机盐的含量为0.5 g·L-1，每组5个重复。

1.5 正交试验设计

表1 正交试验因素与水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

如表 1 所示，设置碳源水平为15 g·L-1、20 g·L-1、25 g·L-1；氮源水平为 2.0 g·L-1、2.5 g·L-1、3.0 g·L-1；无机盐水平为0.3 g·L-1、0.5 g·L-1、0.7 g·L-1；琼脂20 g·L-1，水 1 000 mL。

1.6 温度试验设计

2 结果与分析

2.1 不同碳源对黑皮鸡菌菌丝生长的影响

表2 不同碳源对黑皮鸡菌菌丝体生长的影响Tab.2 Effects of different carbon source formulas on Oudemansiella radicata mycelial growth

表2 不同碳源对黑皮鸡菌菌丝体生长的影响Tab.2 Effects of different carbon source formulas on Oudemansiella radicata mycelial growth

注：“+”表示菌丝的生长势，随着“+”增多，表示菌丝长势越浓密、越粗壮；不同小写字母表示P<0.05水平上的差异显著性。数据为5个重复的平均值±SE。Note:“+” means the growth potential of hyphae.With the increase of“+”,it means the denser and better growth potential of hyphae.The lowercase letters indicate the significant difference at the level of P<0.05.The data were 5 repetitive averages±SE.

碳源 菌丝干重/mg日均生长速度/（mm·d-1）菌丝长势边缘整齐度对照（CK） 0.009 1d 0.369 7a ++ 整齐淀粉 0.042 2bc 0.038 2c +++ 整齐葡萄糖 0.040 1bc 0.375 0a +++ 整齐蔗糖 0.031 0bcd 0.374 3a +++ 整齐乳糖 0.048 4b 0.344 0b +++ 整齐甘露醇 0.022 7cd 0.376 7a +++ 整齐麦芽糖 0.030 2bcd 0.369 7a +++ 整齐果糖 0.071 5a 0.356 7ab +++ 整齐

由表2可知，在以果糖为碳源时，菌丝生长势最优、最为浓厚、生长速度最快，且菌丝干重最大，为0.071 5 mg。因此，适合于黑皮鸡菌菌丝体生长发育的最佳碳源为果糖，其次为乳糖。

2.2 不同氮源对黑皮鸡菌丝体生长的影响

表3 不同氮源对黑皮鸡菌菌丝体生长的影响Tab.3 Effects of different nitrogen source formulas on Oudemansiella radicata mycelia growth

表3 不同氮源对黑皮鸡菌菌丝体生长的影响Tab.3 Effects of different nitrogen source formulas on Oudemansiella radicata mycelia growth

注：“+”表示菌丝的生长势，随着“+”增多，表示菌丝长势越浓密、越粗壮；小写字母表示P<0.05水平上的差异显著性。数据为5个重复的平均值±SE。Note：“+” means the growth potential of hyphae.With the increase of“+”,it means the denser and better growth potential of hyphae.The lower-case letters indicate the significant difference at the level of P<0.05.The data were 5 repetitive averages±SE.

氮源 菌丝干重/mg日均生长速度/（mm·d-1）菌丝长势边缘整齐度对照（CK） 0.002 0f 0.254 0ab ++ 整齐酵母浸膏 0.070 6a 0.259 7ab +++ 整齐酪蛋白胨 0.038 4b 0.273 3a +++ 整齐氯化铵 0.015 4de 0.221 0c ++ 整齐蛋白胨 0.024 9c 0.271 0a +++ 整齐牛肉膏 0.028 2c 0.276 7a +++ 整齐硫酸铵 0.023 3cd 0.232 3bc ++ 整齐硝酸铵 0.010 5de 0.205 0c ++ 整齐硝酸钠 0.023 5cd 0.255 0ab ++ 整齐

如表3所示，以酵母浸膏为氮源时，菌丝生长势最优且干重最大，为0.070 6 mg，明显高于其余处理。综上所述，酵母浸膏为黑皮鸡菌菌丝体生长的最佳氮源，其次为酪蛋白胨。

2.3 不同无机盐对黑皮鸡菌菌丝体生长的影响

如表4所示，以硫酸钾为无机盐时，菌丝体生长速度及生长势最好，菌丝体粗壮，菌丝边缘整齐，干重最大，为0.031 2 mg，而以硫酸锌为无机盐时菌丝几乎不生长。综上所述，硫酸钾为黑皮鸡菌菌丝体生长的最佳无机盐。

2.4 正交试验

正交试验中极差越大表明此因素对试验结果影响越大。L（93）3正交试验结果与极差分析见表5。

表4 不同无机盐对黑皮鸡菌菌丝体生长的影响Tab.4 Effects of different inorganic formulas on Oudemansiella radicata growth mycelia

表4 不同无机盐对黑皮鸡菌菌丝体生长的影响Tab.4 Effects of different inorganic formulas on Oudemansiella radicata growth mycelia

注：“+”表示菌丝的生长势，随着“+”增多，表示菌丝长势越浓密、越粗壮；小写字母表示P<0.05水平上的差异显著性。数据为5个重复的平均值±SE。Note：“+” means the growth potential of hyphae.With the increase of“+”,it means the denser and better growth potential of hyphae.The lowercase letters indicate the significant difference at the level of P<0.05.The data were 5 repetitive averages±SE.

无机盐 菌丝干重/mg日均生长速度/（mm·d-1）菌丝长势边缘整齐度(CK) 0.030 5a 0.191 3a ++ 整齐硫酸镁 0.028 8a 0.194 7a ++ 整齐硫酸钙 0.028 2a 0.184 3a ++ 整齐硫酸锰 0.025 7a 0.191 3a ++ 整齐硫酸锌 0.002 4b 0.010 7b + 整齐硫酸钾 0.031 2a 0.187 0a ++ 整齐氯化钠 0.027 7a 0.185 7a ++ 整齐

表5 L9（33）正交试验结果Tab.5 Results of L9(33)orthogonal test

由表5可知，A、B、C三个因素的极差值R分别为0.006 3、0.013 1、0.009 5，所以影响菌丝体干重的因素依次为最佳氮源浓度＞最佳无机盐浓度＞最佳果糖浓度；A3B3C3是黑皮鸡菌菌丝生长和发育的最佳组合。

2.5 不同温度对菌丝生长影响

不同温度对菌丝生长的影响结果见表6。

表6 不同温度对黑皮鸡菌菌丝体生长的影响Tab.6 Effects of different temperature on Oudemansiella radicata mycelia growth

表6 不同温度对黑皮鸡菌菌丝体生长的影响Tab.6 Effects of different temperature on Oudemansiella radicata mycelia growth

注：“+”表示菌丝的生长势，随着“+”增多，表示菌丝长势越浓密、越粗壮；“-”代表菌丝不生长。Note:“+” means the growth potential of hyphae.With the increase of“+”,it means the denser and better growth potential of hyphae.“+” means that the mycelia didn’t grow.

温度/℃菌丝干重/mg日均生长速度/（mm·d-1）菌丝长势边缘整齐度35 0d 0d - -17 0.006 9c 0.311 0b +++ 整齐20 0.012 4b 0.344 1ab +++ 整齐25 0.025 7a 0.375 0a ++ 整齐28 0.011 0b 0.290 4bc ++ 整齐30 0.010 0bc 0.246 0bc +++ 整齐32 0.000 8d 0.036 4d +++ 整齐

3 结论

通过单因素分析明确了影响菌丝干重的3个因素水平，即黑皮鸡菌菌丝生长的最佳碳源、氮源、无机盐分别为果糖、酵母浸膏、硫酸钾。张兵等[16]研究表明碳源对黑皮鸡菌菌丝生长有着很大影响，而氮源和维生素的含量对其没有多大影响，作者将文章中出现这样结果的原因归结为碳源在培养基中占很大的比例，而氮源和生长因子所占成分较小，所以影响不大。吕英华等[17]对野生桑黄固体培养基优化中得出氮源是影响最大的。所以，本次试验结果中得出氮源是对其菌丝生长影响最大的结论，可能由于地区原因以及品种原因，在延边地区，对黑皮鸡菌菌丝生长促进作用最大的是酵母浸膏。对于不同品种在延边地区生长的最适条件中氮源是否一直是影响最大的因素还有待进一步研究。