外周血宏基因组二代测序对肺孢子菌肺炎的诊断价值

顾 鹏 许书添 姜 雪 周玉超 周 云 李 喆 李世军

耶氏肺孢子菌(PJ)是一种机会感染性病原体,可引起致命性的肺孢子菌肺炎(PCP)。随着免疫抑制剂、放化疗的广泛应用,PCP在器官移植、自身免疫疾病、肿瘤等患者中呈现不断增加趋势[1]。肾脏移植与多种肾脏疾病的患者因长期使用糖皮质激素及免疫抑制剂,可处于免疫抑制状态[2]。在此类患者PCP并不少见,可导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS),常需要机械辅助通气,病死率高[3]。及时诊断和启动PCP特异性治疗是降低病死率的关键[4]。但PCP的早期病原学诊断困难,需要进行肺泡灌洗,并在显微镜下检出肺孢子菌或者聚合酶链式反应(PCR) 阳性来确诊,部分患者不能耐受肺泡灌洗等有创检查,病原检出率低[5],容易延误诊治。宏基因组二代测序(mNGS)技术已被广泛用于多种感染性疾病的研究,在血液、脑脊液及呼吸道标本中均表现出良好的诊断性能[6]。有研究发现,mNGS在外周血中检出PJ序列,并结合患者的临床表现和影像学特征,可以确诊PCP,但在临床中仅有少数案例[7]。本研究将mNGS用于肾脏病免疫抑制患者合并PCP的外周血样本的检测,旨在前瞻性探索外周血中mNGS对于PCP病原学的诊断价值。

对象和方法

研究对象选取2018年8月至2019年12月,因肾移植或其他肾脏疾病接受免疫抑制治疗,并发肺部感染入住国家肾脏疾病临床医学研究中心重症监护病房的患者。

入选标准(1)入选的患者为肾移植术后或其他肾脏疾病,有接受糖皮质激素长期治疗(>30d)和或高剂量糖皮质激素[>1 mg/(kg·d)],或其他免疫抑制药物治疗史(>30d);(2)临床拟诊为PCP,即具有以下表现者作为观察组[4]:合并呼吸困难、进行性缺氧等表现;胸部高分辨率CT可见磨玻璃样改变和(或)肺间质弥漫浸润病变等典型改变。(3)另选取临床确诊为其他病原(细菌、真菌、病毒等)导致肺部感染的患者作为对照组。

相关定义ARDS指肺部急性病变导致的以低氧血症为特征的临床综合征,即氧合指数(动脉氧分压/吸入氧浓度)≤300 mmHg、并且呼吸末正压或持续气道正压≥5 cmH2O;根据氧合指数分为轻度(200～300 mmHg)、中度(100～200 mmHg)及重度(<10 mmHg)。真菌G联合乳酸脱氢酶(BG/LDH)检测:由于获得PCP病原学诊断极为困难,在缺乏PCP病原学诊断时,临床上常在肺部影像学呈双肺磨玻璃影样改变的患者中使用血清1,3-β-D葡聚糖(BG,真菌G)试验阳性(>60 pg/ml)且乳酸脱氢酶(LDH)升高(>618 U/L)作为诊断PCP的标准[8-9];采用急性生理与慢性健康评分系统Ⅱ(APACHEⅡ评分):评估患者的病情危重程度[10]。

mNGS检测流程和方法(1)采集患者的血液样本均符合mNGS检测要求(使用K管采集的外周血样本不少于3 ml、6～35℃储存),使用BGISEQ-500/50平台测序。测序结果去除低质量的和长度小于35bp的数据以获得高质量数据。通过BWA(BWA:http://bio-bwa.sourceforge.net/)比对将人源核酸序列的数据去除。剩余数据在去除低复杂度序列后与专用的微生物数据库比对,测序后的数据按照病毒、细菌、真菌和寄生虫等进行分类和排列。(2)在采集mNGS血液样本的同时送检对应的血培养、痰或肺泡灌洗液(BALF)病原(细菌、真菌)培养(时间差≤1天)。病原培养、胸部高分辨率CT和其他检测均在国家肾脏病临床医学研究中心相关科室完成。

观察资料(1)患者的基本信息:年龄、性别、基础疾病、免疫抑制方案、患者转归;(2)肺部感染相关指标:ARDS分级、肺部影像学表现;(3)免疫指标:CD4+淋巴细胞计数、真菌G试验、乳酸脱氢酶、降钙素原、C反应蛋白等;(4)mNGS病原检测:样本类型、采集时间、检测结果、病原种类及序列、细菌培养的检测结果。

统计学方法采用《SPSS 22.0》软件进行统计学分析,计数资料用“例数”和“率”表示;计量资料以均值±标准差表示,含极端值的计量资料使用中位数表示;符合正态分布的组间比较采用独立样本t检验;不符合正态分布的比较采用秩和检验;定性资料以频数(%)表示,采用卡方检验、Fisher精确检验进行比较,P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

病例临床特征 观察组入选37例患者,男性20例,女性17例;平均年龄45.8岁(表1),原发病因包括11例肾移植受者、7例IgA肾病、7例膜性肾病，冷球蛋白血症、足细胞病和局灶性节段硬化各2例,膜增生性肾小球肾炎、IgM肾病、单克隆免疫球蛋白病、ANCA相关性肾炎、过敏性紫癜性肾炎和狼疮性肾炎各1例;对照组入选25例其他病原(19例细菌、3例曲霉、3例病毒)引起肺部感染的患者,包括8例肾移植受者,5例狼疮性肾炎,膜性肾病和冷球蛋白血症各2例,足细胞病、微小病变、系统性淀粉样变性、POEMS综合征和抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)相关性肾炎各1例,3例未行活检。

表1 入组患者的基本情况

ARDS：急性呼吸窘迫综合征；APACHE Ⅱ：急性生理与慢性健康评分

mNGS检测观察组37例患者,送检了37份外周血样本。其中35份检出了PJ序列(阳性),同时检出了其他病原序列(表2、图1)。2例(样本8、21)未检出PJ序列(阴性)的,其中1例1周后重复送检结果阳性。对照组送检25份外周血样本,PJ序列均为阴性。

表2 入组病原检出结果

mNGS：宏基因组二代测序技术；Culture：病原培养；Type：标本类型；BALF：肺泡灌洗液；HSV:人类疱疹病毒1型;VZV:人类胞疱病毒3型;EBV:人类疱疹病毒4型;CMV:人类疱疹病毒5型

图1 观察组mNGS检测结果

BG/LDH检测在观察组中,有33例患者真菌G试验阳性且LDH升高,另4例患者多次检测真菌G试验结果均为阴性。而在对照组中,有11例真菌G试验阳性且LDH升高,真菌G试验阳性的原因考虑合并其他真菌感染或假阳性。

检测效能mNGS检测在外周血中诊断PCP的敏感度94.59%,特异度100%;真菌G联合LDH检测的敏感度89.19%,特异度56.0%。在外周血中使用mNGS诊断PCP,其特异度较缺乏病原学、仅通过真菌G试验阳性联合LDH升高诊断PCP有显著优势(表3)。

表3 两种方法结果比较

mNGS：宏基因组二代测序技术；BG/LDH：真菌G联合乳酸脱氢酶检测

其他病原检测结果观察组37例患者中,有31例使用mNGS检出了合并感染的其他病原序列。合并病毒感染27例,其中19例(51.4%)检出了巨细胞病毒(CMV,人类疱疹病毒5型),6例检出了EB病毒(EBV,人类疱疹病毒4型),5例检出了单纯疱疹病毒(HSV,人类疱疹病毒1型),7例检出了细环病毒属。有8例合并细菌感染,其中葡萄球菌属2例,不动杆菌2例,肺炎克雷伯菌1例,大肠埃希菌1例,其他不常见菌属4例。病原(细菌、真菌)培养结果:观察组所有血培养结果均为阴性(培养5天均无菌生长),2例鲍曼不动复合杆菌(1例痰、1例BALF),1例阴沟肠杆菌(BALF),1例肺炎克雷伯菌(痰),1例产吲哚黄杆菌(痰),1例白色念珠菌(痰),1例铜绿假单胞菌(痰)。NGS和细菌培养检出的病原种类见表2、图1。

治疗与预后观察组中所有患者均给予复方磺胺甲噁唑片联合棘白菌素抗PJ治疗,以及广谱抗生素防治细菌感染,有1例患者因合并曲霉感染给予抗曲霉治疗,有4例患者针对巨细胞病毒给予抗病毒治疗。31例患者在病程中合并ARDS,其中11例需要机械辅助通气治疗。经治疗后,有29例病情好转,8例死亡。对照组患者给予广谱抗生素防治细菌感染,有3例给予抗曲霉治疗,有3例给予抗病毒治疗。9例患者合并ARDS,5例接受机械辅助通气治疗。最终有20例病情好转,5例死亡。

讨 论

PCP的传统病原学诊断方法通过采集患者的呼吸道标本(痰液、肺泡灌洗液),染色后在显微镜下发现PJ的包囊或滋养体为确诊依据,这种诊断技术受到染色方法、标本采集、病原载量等多种因素影响,其准确性、检出率低。PCR技术通过检测呼吸道标本中PJ的DNA序列来确诊PCP,在痰标本中检出率低,本研究中有5例患者病程中送检痰标本PCR检测均为阴性(结果未发表),在肺泡灌洗液中有较高的敏感度(91.3%～99.7%)和特异度(82.7%～95.5%),但需要支气管肺泡灌洗术,部分重症患者难以耐受[11]。也有研究使用mNGS检测PCP患者的呼吸道标本,显示出较好的检测效能[6]。由于耶氏肺孢子菌在人类Ⅰ型肺泡细胞表面定植和生长,非HIV的免疫缺陷患者中定植率较高(17.14%)[12],使用PCR或者其他基因检测等方法对呼吸道标本的检测,难以确定合适的阈值来区分感染或定植[13]。

本研究通过mNGS检测PCP患者外周血中的病原序列,证实了这种方法用于PCP的诊断,具有较高的敏感度(94.59%)和特异度(100%),送检样本后72h内即可得出检验结果。不但具有无创、简便、快速的优点,而且避免了PJ在呼吸道定植的干扰,相对于肺泡灌洗、肺组织活检等有创检查方法极具优势。血中检出PJ序列的原因,有研究认为是由于患者免疫系统受损时,PJ能够穿透局部的感染部位进入外周血导致[6]。观察组中2例样本结果阴性的原因:2例患者前期病情较轻,可能肺孢子菌尚未进入外周血。其中1例患者1周后复查结果阳性。mNGS结果中检出序列数(reads)是指匹配到该病原的序列数目,其多少与标本中病原体本身载量负荷、核酸提取量、人源序列比例有关,数值越高,表示检测到该病原体的可信度越高[14],PJ序列数仅对PCP的诊断有意义,与PCP的病情严重程度及预后尚无明显相关。

在缺乏PCP的病原学诊断时,临床医师常通过PCP特征性的肺部表现、真菌G试验阳性联合乳酸脱氢酶升高作为诊断依据。PCP特征性肺部改变是以两肺间质性和肺泡性病变为基础,依病情进展表现出磨砂玻璃型、斑片型、间质型、囊变型四种类型,临床上较难与巨细胞病毒或其他肺间质疾病鉴别[15]。真菌G试验可因合并其他真菌感染出现阳性,部分重症患者需要血液透析治疗、或使用白蛋白、免疫球蛋白等药物而出现假阳性。一些研究认为真菌G试验阴性可以排除PCP[16],但在本研究中,有4例临床诊断PCP的患者病程中多次检测真菌G试验均为阴性,其他研究也有类似情况[6]。此外,乳酸脱氢酶广泛存在于人体各组织中,肺部感染和多种肺外疾病中都能引起LDH升高,特异性较差。对照组中12例患者起病初期有类似PCP的肺部影像学表现。有11例患者真菌G试验阳性伴LDH不同程度的升高,本研究中使用真菌G联合LDH诊断PCP的方法特异性欠佳(56%),因此,在缺乏病原学诊断时,可能会导致对非PCP患者使用抗PJ治疗,增加了潜在药物不良反应的风险。

mNGS检测的另一个优势是可以在锁定某种病原体同时检测混合感染。本研究中mNGS在检出PJ序列的同时,也显示了合并其他感染的病原序列,特别对病毒显示出较高的阳性率,37例患者中有27例(73%)检出了不同的病毒序列,其中以CMV最为突出。有研究指出,合并CMV、HSV是非HIV感染的PCP患者预后不良因素之一,也是其免疫抑制状态的间接标志[17]。本研究中合并CMV的19例患者最终有6例(31.6%)死亡,其中1例同时合并HSV及EBV。在未合并CMV的18例患者中,有2例死亡。对于PCP合并CMV的患者,可能需要同时联合抗病毒治疗。

淋巴T细胞减少和功能低下是PCP患者的特征之一,指南中把CD4+淋巴T细胞计数<200个/μl作为PCP感染高风险的因素,同时作为启动初级预防治疗的指征,并将 CD4+淋巴细胞恢复超过200个/μl作为可以停止预防治疗的参考标准之一[18]。本研究发现,在临床诊断PCP患者(观察组)中,有12例患者CD4+T淋巴细胞计数超过200个/μl,甚至其中4例>400个/μl,此类患者的病情较轻,预后好。因此,临床上对于符合PCP临床表现的接受免疫抑制治疗的肾脏病患者,即使CD4+计数较高,也需要排除PCP。

本研究是目前样本量最大的,将mNGS用于肾脏病免疫抑制患者合并PCP的单中心研究。发现了mNGS在外周血中检出PJ序列可以作为PCP的病原学诊断依据,提高了PCP的早期诊断率,为临床医师在疑似PCP患者中使用抗PJ治疗提供了病原学依据,也避免了不合理用药。同时,本研究还发现PCP还可能合并其他病原体感染(特别是CMV),为临床医师及时采取相应的治疗措施提供了方向,改善患者的预后。同时本研究提出CD4>200个/μl不能作为接受免疫抑制治疗的肾病患者排除PCP的指标。本研究尚存在以下不足,缺乏呼吸道标本染色镜检或PCR等其他PCP病原学诊断方法,对检出合并感染的病毒序列,缺乏特异性血清抗体等方检测法作为对照。

小结:mNGS作为新兴的病原学基因检测诊断技术,用于诊断PCP不但具有准确快速的特点,避免呼吸道定植的干扰,还可以检出合并的混合其他病毒或细菌感染,较PCP的其他病原学诊断方法更具优势。对免疫抑制合并肺部感染患者的诊断有重要的指导意义。