白藜芦醇对代谢综合征大鼠肠道主要菌群的影响

缪萍， 李竞， 周飞， 李强

（1.宁波市鄞州人民医院，浙江宁波 315040；2.宁波大学医学院，浙江宁波 315211）

代谢综合征（MS）是以中心性肥胖、高血压、脂代谢异常、糖尿病或糖耐量受损等聚集出现为主要特点[1]，以胰岛素抵抗（IR）为共同病理生理基础的代谢紊乱症候群[2]，已成为全球公共健康主要问题。肠道菌群被称为人类的“第二基因组”，参与机体营养吸收与代谢、免疫调节等生理过程。若肠道微生态结构失衡，将导致肥胖、糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的发生和发展[3]。本课题组前期研究发现，白藜芦醇能有效控制MS大鼠体质量和血压，减少腹腔脂肪蓄积，纠正糖脂代谢紊乱和改善IR。因此，本研究拟通过观察白藜芦醇对MS 大鼠肠道菌群的调节作用，探讨肠道菌群、炎症因子及脂肪代谢相关基因三者之间的相关性，为进一步的机制研究和治疗策略提供依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物及饲料SPF 级雄性SD 大鼠32 只，体质量（200 ± 20）g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（浙）2014-0001。饲养于宁波大学实验动物中心，自由进食饮水。高脂高盐高糖饲料（按质量分数配方：基础饲料56%、猪油15%、蔗糖15%、蛋黄10%、食盐2%、胆固醇2%），购自北京科澳协力饲料有限公司。

1. 2药物、细菌、试剂与仪器白藜芦醇（批号：FY10700805）购自江苏南通飞宇生物科技有限公司，用蒸馏水配制成浓度为20 mg/mL 的混悬液；盐酸二甲双胍片（批准文号：国药准字H20023370），由中美上海施贵宝制药有限分司生产，使用前用蒸馏水配成浓度为30 mg/mL 的溶液。以上药液均置于4 ℃冰箱保存。实验细菌有2 种需氧菌属（大肠杆菌、链球菌），2 种厌氧菌属（双歧杆菌、乳酸杆菌），由本院微生物实验室提供。肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司；RNA 抽提试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；逆转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。SMA 4000 微量紫外分光光度计（美国Merinton 公司）；SCIENTZ-48 高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Spectra Max Plus 384 酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；Wellwash 4 MK2 洗板机（美国Thermo 公司）；CFX connect 荧光定量PCR 仪（美国Bio-RAD 公司产品）；Avanti J-E 多用途高效离心机（美国Beckman公司）。

1.3动物分组、造模与给药32只大鼠适应性饲养7 d 后，按随机数字表分为正常组8 只、造模组24只。采用高脂高盐高糖饮食喂养16周建立MS大鼠模型[4]。若大鼠出现腹型肥胖、高血压、血糖血脂异常、高胰岛素血症等特征，则判断造模成功。12周后，将复制成功的MS模型大鼠随机分为模型组、白藜芦醇组和二甲双胍组，每组各8 只。参照文献[5]制定白藜芦醇灌胃剂量为100 mg/kg；二甲双胍根据成人临床日用量，按体表面积折算动物有效剂量，得出灌胃剂量为150 mg/kg；正常组和模型组灌胃等体积蒸馏水，给药体积为5 mL/kg。每日1次，连续4周。在造模及干预期间正常组给予基础饲料。

1. 4标本留取末次给药后，禁食不禁水12 h，在无菌条件下收集大鼠直肠内容物。腹腔注射25%乌拉坦4 mL/kg 麻醉，腹主动脉取血，以3 000 r/min离心20 min，分离血清，储存于-70 ℃冰箱中。剪取肝脏左叶相同部位组织，-70 ℃冻存待检。

1.5检测指标和方法

1. 5. 1 肠道菌群检测[6]取各组大鼠粪便0.1 g，置于装有玻璃珠的无菌试管中。按1∶9加入灭菌生理盐水涡旋振荡至粪便均匀化，采用10 倍稀释法用生理盐水将粪便悬液依次稀释至10-8浓度。取菌液50 μL接种于各种培养基上，需氧菌在普通温箱37 ℃培养24 h，厌氧菌在厌氧箱中培养48 h。以菌落形态、革兰氏染色和生化反应鉴定细菌，计数培养基上生长的菌落数，结果以每1 g粪便中菌落数的对数值（lg CFU/g）表示。

1.5.2 血清TNF-α、IL-1β、IL-6 含量测定 按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，应用酶标仪于450 nm 波长处测吸光值，绘制标准曲线，计算TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.5.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测肝脏禁食诱导脂肪因子（Fiaf）、脂蛋白脂酶（LPL）、乙酰辅酶A羧化酶α（ACCα）、脂肪酸合成酶（Fas）

mRNA 表达水平 Trizol 法提取总RNA。逆转录合成cDNA，反应条件：50 ℃15 min，85 ℃2 min。Fiaf 引物为5’-CGCCTGAACGGCTCTGTG-3’（F），5’-CGGTCCCCTGTGATGCTG-3’（R），119 bp；LPL 引物为5’-CTGGCGTGGCAGGAAGTC-3’（F），5’-AATCCGCATCATCAGGAGAAA-3’（R），120 bp；ACCα 引物为5’-ATGCCGGGCCATTGGTA-3’（F），5’-TGGGTAACTCCGTTGTTGTGC-3’（R），183 bp；Fas 引物为5’-ACAGTGGCGTGGAATGGG-3’（F），5’-AATCTGGATGGCGGTGAGG-3’（R），181 bp；β-actin引物为5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’（F），5’- TCAGAGGGAGTGAGGATGCC-3’（R），150 bp。扩增反应 程 序：95 ℃30 s，95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 个循环。结束后进入熔解曲线采集程序，从70 ℃开始每5 s 将温度提高0.5 ℃并采集荧光信号，直至温度达到95 ℃。以β-actin 为内参，采用Livak（2-△△Ct）法进行基因相对表达量分析。

1.6统计方法采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，先行正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布采用单因素方差分析进行组间比较，不符合正态分布采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1白藜芦醇对MS大鼠肠道菌群的影响表1结果显示：模型组大鼠肠道内大肠杆菌与链球菌的数量明显增加，双歧杆菌和乳酸杆菌的数量明显减少，与正常组比较，差异有统计学意义（均P＜0.01）。与模型组比较，白藜芦醇组和二甲双胍组大肠杆菌、链球菌数量明显减少，双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组大鼠肠道菌群数量的变化Table 1 Comparison of the number changes in gut microbiota in rats of various groups （±s，lg CFU/g）

表1 各组大鼠肠道菌群数量的变化Table 1 Comparison of the number changes in gut microbiota in rats of various groups （±s，lg CFU/g）

①P ＜0.01，与正常组比较；②P ＜0.05，③P ＜0.01，与模型组比较

组别正常组模型组白藜芦醇组二甲双胍组N/只8 8 8 8大肠杆菌6.74±0.39 7.99±0.35①7.40±0.33②7.15±0.56③链球菌5.90±0.47 7.24±0.40①6.72±0.36②6.59±0.42②双歧杆菌11.37±0.45 9.06±0.48①9.88±0.22③10.00±0.43③乳酸杆菌11.80±0.37 10.89±0.27①11.35±0.40②11.42±0.41②

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较Table 2 Comparison of the serum levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in rats of various groups [±s，ρ/（pg·mL-1）]

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比较Table 2 Comparison of the serum levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in rats of various groups [±s，ρ/（pg·mL-1）]

①P ＜0.01，与正常组比较；②P ＜0.05，③P ＜0.01，与模型组比较

组别正常组模型组白藜芦醇组二甲双胍组N/只8 8 8 8 TNF-α 108.29±20.51 195.25±27.49①153.60±36.71②145.80±31.45③IL-1β 50.79±13.25 117.57±20.63①91.75±14.43②86.08±18.39③IL-6 141.56±28.85 298.72±34.59①201.78±40.83③206.49±48.21③

2. 2白藜芦醇对MS大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量的影响表2 结果显示：与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量显著升高（P＜0.01）；白藜芦醇组和二甲双胍组TNF-α、IL-1β和IL-6含量均较模型组明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。

2.3白藜芦醇对MS大鼠肝脏Fiaf、LPL、ACCα、Fas mRNA表达量的影响图1 结果显示：与正常组比较，模型组大鼠肝组织Fiaf mRNA表达量明显降低（P＜0.01），LPL、ACCα 和Fas mRNA 表达量显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，白藜芦醇组和二甲双胍组均能显著上调Fiaf mRNA 表达量（P＜0.05），有效下调LPL、ACCα 和Fas mRNA 表达量（P＜0.05或P＜0.01）。

图1 各组大鼠肝组织Fiaf、LPL、ACCα、Fas mRNA表达量比较（±s）Figure 1 Comparison of the mRNA expression levels of Fiaf，LPL，ACCα and Fas in liver tissue of rats invarious groups（±s）

3 讨论

人类肠道内定植着数十万亿、上千种细菌，与宿主存在着密切的共生关系。主要分为厚壁菌门、放线菌门、拟杆菌门和变形菌门等四类厌氧菌。其中，厚壁菌门还包括乳酸杆菌、支原菌、芽孢杆菌和梭菌等200多种类型。厚壁菌门和拟杆菌门在整个菌群系统中占有绝对优势（约占90%以上）[7]，这两种菌群在肠道中所占的比例将影响宿主摄取能量物质的能力。Ley 等[8]发现瘦素缺失的肥胖小鼠与正常普通小鼠的肠道细菌不同，主要表现为厚壁菌门含量增加，而拟杆菌门的含量降低。Bäckhed 等[9]发现，肠道菌群可调节宿主能量贮备，无菌小鼠摄入热量高于正常普通小鼠的29%，而全身脂肪含量低于其40%。若将正常小鼠的肠道菌群移植到无菌小鼠体内，在不改变饲料摄取和能量消耗的情况下，无菌小鼠的身体脂肪总量仍增加了60%，肝脏甘油三酯升高2.3倍。成扬等[10]研究表明，酒精性脂肪肝大鼠肠道菌群结构改变的同时，伴有转氨酶和脂多糖（LPS）升高，肝细胞受损。而健脾活血方对其有良好的保护作用，其机制可能与调节肠道微生态失衡有关。本研究结果提示，MS 大鼠存在明显的肠道菌群失调，大肠杆菌、链球菌等条件致病菌含量增加，双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌含量减少。白藜芦醇可以调节MS大鼠肠道微生态环境，提高益生菌比例，并降低条件致病菌比例，使紊乱的肠道菌群结构趋于正常。

有研究发现，低水平炎症反应是肥胖及相关代谢性疾病的一个重要机制[11]。长期摄入高脂饮食导致肠道微生态结构改变，使LPS吸收增加，通过与免疫细胞表面的复合受体CD14/Toll 样受体4（TLR4）结合，激活免疫系统，触发促炎细胞因子的释放，引起炎症级联反应，从而诱发肥胖。Cani等[12]证明，与正常对照组比较，高脂饮食喂养4周后的小鼠能量摄入过多，伴随肠道菌群发生改变（拟杆菌减少），血液中LPS 增加2 ～3 倍，这种症状也被称为“代谢内毒素血症”。肠道菌群可能通过调节炎症通路影响宿主的代谢。本研究结果显示：白藜芦醇可以显著降低MS 大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，减轻炎症因子对肠黏膜的损伤，改善肠道屏障功能。

肠道菌群可通过调节参与脂质代谢的因子影响饮食中脂质的吸收、储存和利用。肠道菌群发酵多糖产生的碳水化合物进入肝脏和脂肪细胞，通过激活2种转录因子，即碳水化合物应答元件结合蛋白（ChREBP）和胆固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1），进一步激活肝脏2种脂肪酸合成关键酶ACCα 和Fas 的活性，促进肝脏和脂肪组织甘油三酯的合成和堆积[13-14]。肠黏膜上皮细胞产生的Fiaf是血管生成素样蛋白的家族成员，是过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）的新靶点，是一种新的下丘脑调节器[15]。肠道的乳酸菌能够诱导Fiaf基因的表达，高脂喂养的小鼠补充乳酸菌后Fiaf活性升高，通过抑制LPL 的活性，减少脂肪酸的摄入和甘油三酯在脂肪组织中的蓄积[16]。本研究结果表明，白藜芦醇能明显提高MS 大鼠肝脏Fiaf 活性，降低LPL、ACCα、Fas等脂肪细胞关键转录因子的表达。

由此推测，白藜芦醇可能通过改善肠道微环境，促进肠道益生菌生长，进而缓解炎症反应，纠正脂代谢紊乱，延缓MS的发展进程。