枸杞酒发酵过程中的褐变

郭晓梦，张一晟，王 菁，张惠玲*

（1.宁夏大学 农学院 宁夏银川750021；2.宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室，宁夏银川750021）

枸杞（Lycium barbarum）富含多种生物活性物质，具有较好的营养价值和药理活性，是我国传统药食两用的名贵中药材[1-2]。枸杞发酵酒是以枸杞为原料，经酵母菌发酵而成的一种保健果酒，营养丰富，深受消费者喜爱[3]。但是枸杞酒容易发生褐变，不仅对色泽和风味造成影响，同时会降低营养价值[4]，制约着枸杞酒行业的发展。目前，我国对于枸杞酒的研究多集中于制作工艺及产品开发[5-7]，对枸杞酒褐变的研究十分少。作者针对枸杞酒制备中发生褐变因素进行研究，为进一步控制枸杞酒的色泽变化提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

鲜枸杞：宁夏百瑞源股份有限公司；酿酒活性干酵母Excellence XR：法国Lamothe-Abiet公司；五羟甲基糠醛、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、对香豆酸、没食子酸、芦丁、槲皮素、山奈酚、冰乙酸、甲醇：均为HPLC，纯度≥99%，北京中科质检生物技术有限公司；福林试剂、没食子酸、愈创木酚：均为AR，麦克林公司；邻苯二酚、2，6-二氯酚靛酚、3，5-二硝基水杨酸、乙酸乙酯、VC：均为AR，北京奥博星生物技术有限责任公司。

仪器与设备：高效液相色谱仪1100 Series，美国安捷伦科技有限公司；紫外可见分光光度计V-5100，上海精科实业有限公司；旋转蒸发仪RE-52，上海亚荣生化仪器厂；L-8900全自动氨基酸分析仪，日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 枸杞酒的制作流程鲜枸杞→清洗→破碎、打浆→添加亚硫酸→加入果胶酶、酶解→调节糖酸→过滤→接种酵母→发酵（18℃）→取上清液→陈酿→过滤→灌装→成品酒。

1.2.2 操作要点枸杞汁预处理：将鲜枸杞清洗、沥干后，以料水质量体积比1∶3打浆，加入亚硫酸，使SO2的质量浓度达到60 mg/L。加入40 mg/L果胶酶，45℃酶解4 h，调节糖度至20°Bx，调pH 3.3～3.5，过滤取汁发酵。

接种发酵：将活化后的酵母菌按0.2 g/L接入枸杞汁中，于18℃恒温培养箱中发酵。每天定时取样，测定相关参数，当糖质量浓度不再下降时停止发酵，取上清液进入陈酿，测定各项指标作为陈酿初酒指标。

陈酿：枸杞酒在16℃恒温条件下陈酿90 d，每15天取样并测定各项指标。由于陈酿中的酶活很小，实验主要针对非酶褐变因子进行测定。

1.2.3 测定方法pH值：pH计测定；酒精体积分数：密度瓶法，参照《GB/T 15308 2006葡萄酒、果酒通用分析方法》[8]进行测定；还原糖：采用3，5-二硝基水杨酸法[9]；VC的测定：采用2，6-二氯酚靛酚法，参照GB 5009.86-2016进行测定[10]。PPO和POD活性的测定：PPO和POD的提取和测定参照赵凤[11]等人方法；总黄酮的测定：采用分光光度计法，参照王静[12]的方法。

褐变度的测定：采用消光值法[13]。将枸杞酒待测液在420 nm波长处测定吸光度值，用来表示褐变，吸光值越大，褐变越严重。重复测定3次。

游离氨基酸的测定：氨基酸分析仪（茚三酮柱后衍生离子交换色谱仪）测定。

总酚的测定：采用Folin-Ciocalteu法[14]，以没食子酸计，所绘制标准曲线为：y=10.81x+0.091 1，R2=0.998 3。样品总酚测定：将1 mL待测液稀释10倍，取1 mL稀释样液进行测定。

酚类物质质量浓度测定：采用高效液相色谱法。取30 mL枸杞酒，参照李朋亮[15]的方法对样品进行处理后上机测定。10种酚类物质标准品色谱图见图1，采用外标法所得10种酚类物质工作曲线方程见表1。

图1 10种单体酚类物质标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of 10 phenolic compounds

表1 10种单体酚类物质标准品工作曲线的回归方程Table 1 Equation of liner regression of 10 phenolic compounds

5-HMF的测定：采用HPLC方法，称取5-HMF标准品0.010 g，V甲醇∶V水=1∶1，定容至100 mL容量瓶，作为标准品溶液。取待测液20 mL，用20 mL乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，35℃下旋转蒸干后用2 mL甲醇-水（体积比1∶1）溶解，0.45μm有机滤膜过滤后进样。

液相色谱条件为：柱温30℃，检测波长284 nm，流动相A为甲醇，B为V乙酸∶V水=1∶99，等梯度洗脱，流量为1.0 mL/min。样品进样前经0.45μm有机滤膜过滤，进样量为20μL，检测时间30 min。

HMF标准品色谱图见图2，所得标准曲线为：y=8 055.8x＋36.624，R2=0.999 9。

统计分析方法：使用SPSS17.0对陈酿过程中主要非酶褐变因素与褐变度进行通径分析，分析前对数据进行标准化处理。

图2 5-HMF标准品色谱图Fig.2 Chromatography of 5-HMF standard

1.2.4 建立枸杞酒褐变模拟体系枸杞酒是一个复杂的体系，在分析陈酿中的褐变因素时，多因素交叉，为了证明实验所得褐变因素的正确性，作者拟通过构建模拟体系进行验证。以葡萄糖作为实验中的还原糖，原始物质质量浓度以枸杞酒陈酿中第一次取样为准。以枸杞酒中各游离氨基酸、总糖、还原糖、总酚包括黄酮、10种酚类物质、VC和5-HMF为指标，与褐变度（A420）进行通径分析，研究其非酶褐变主要影响因素。为了便于观察，模拟参数设计是在原酒的数据上扩大了10倍，配制乙醇柠檬酸缓冲液（11.64%乙醇，pH 3.22），将各模拟体系于50℃存放20 d，每5天取样，测定其褐变度的变化，见表2。

表2 枸杞酒模拟体系的构建Table 2 Construction of medlar wine model system

2 结果与分析

2.1 发酵过程中褐变度影响

2.1.1 酶促褐变因素对褐变度的影响

1）酶与总酚的影响 从图3可以看出，两种酶与总酚在进入最旺盛阶段变化较大，酶促褐变与非酶褐变共同参与，使褐变度一直上升，说明发酵过程中一直伴随着褐变反应。枸杞中含有丰富的酚类物质，酚类中的一元酚邻位羟基物质容易被PPO催化，形成邻二酚并发生脱氢反应，生成具有高度氧化活性的邻醌，邻醌通过自身聚合或与多酚、蛋白质、金属离子等结合发生共呈色作用，生成导致颜色越来越黄的多聚体，并最终形成不溶性的褐色多酚—黑色素，使枸杞酒的黄化发展为褐化。

图3 发酵过程中酶、总酚与褐变度的变化Fig.3 Changes of enzymes，total phenolic and browning during wine fermentation

2）主要单体酚对褐变度的影响 芦丁是枸杞中含量最高的类黄酮物质，其次是绿原酸和阿魏酸。从图4—5可知，这些物质下降幅度较大。因为芦丁结构苯环上含有4个羟基，其中包括2个邻羟基，容易被PPO催化，形成醌类物质或与醌类物质缩合引起褐变；芦丁具有较强的金属离子螯合能力，能与Fe2+等金属离子发生螯合反应，生成黄色、蓝绿色和黑色等有色螯合物[16]，从而加速枸杞酒的褐变。槲皮素含有5个羟基包括2个邻位羟基，其酶促褐变反应活性与芦丁相似。山奈酚不含邻羟基，发酵过程中可能是发酵液环境变化使细胞释放。

图4 发酵过程中类黄酮主要单体酚变化Fig.4 Changes of major phenolic compounds in flavonoid during wine fermentation

图5 发酵过程中非类黄酮主要单体酚变化Fig.5 Changes of major phenolic compounds in nonflavonoid during wine fermentation

2.1.2 非酶促褐变因素对褐变度的影响枸杞中的非酶褐变主要来自VC氧化、还原糖和氨基酸的美拉德反应。由图6可知，枸杞发酵液中VC从开始就迅速氧化降解，随着发酵后期溶解氧被酵母菌大量消耗，以及多酚类物质和VC竞争式的氧化还原平衡，能一定程度保护VC，使VC下降速度变得缓慢。VC分子中含有连烯二醇基[-C（OH）=（OH）-]和内酯环结构，极易氧化分解形成脱氢抗坏血酸，经脱水形成DKG（2，3一二酮古洛糖酸）后，脱羧产生酮木糖，最终生成还原酮，进一步脱水与氨基化合物缩合或自身裂解，最终形成类黑精[17]，使枸杞酒褐变度上升。

图6 发酵过程中VC、5-HMF与褐变度的变化Fig.6 Changes of VC，5-HMF and browning degree during wine fermentation

5-HMF是还原糖和氨基酸进行美拉德反应的中间产物，它的生成量能一定程度指示美拉德反应的进行。还原糖和氨基酸经1，2-烯醇化反应，脱水形成3-脱氧奥苏糖，继续脱水生成5-HMF，最终产物主要为类黑素[18]。从图6可以看出褐变曲线一直上升。

2.2 陈酿过程中褐变度的影响

2.2.1 总酚与褐变度的变化由图7可知，随着陈酿时间的延长，褐变不断产生。陈酿中除了多酚氧化聚合、VC氧化降解和美拉德反应的持续外，多酚氧化中间物质醌类还可以与酚等物质通过亲核、偶联或自由基途径发生非酶聚合，反应过程中产生的二聚体或多聚体可能发生了结构重排，产生褐色的多聚体[19]也使得总酚物质下降。

图7 陈酿过程中褐变度和总酚的变化Fig.7 Changes of browning degree and total phenolic during wine aging

2.2.2 主要单体酚的变化在陈酿中，枸杞酒中主要的单体酚芦丁、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸和没食子酸质量浓度均有下降，其原因与发酵过程相同，见图8—9。

图8 陈酿过程中类黄酮中主要单体酚变化Fig.8 Changes of major phenolic compounds in compounds flavonoids during wine aging

图9 陈酿过程中非类黄酮主要单体酚变化Fig.9 Changes of major phenolic in non-flavonoid during wine aging

2.2.3 游离氨基酸的变化由表3可知，除了Asp和Gly质量浓度增加了，其他氨基酸都有所下降，脯氨酸下降最大，有研究表明[20]，脯氨酸最具类黑精形成活性，是褐变反应活性最高的氨基酸。钱敏[23]等人发现，谷氨酸参与的美拉德反应产物中5-HMF质量浓度较高。

表3 陈酿90 d后氨基酸的变化Table 3 Changes in amino acids after 90 days of aging

2.2.4 总糖、还原糖、5-HMF和VC的变化通过5-HMF与VC的变化可知，陈酿中的美拉德反应一直在进行，VC一直在持续，褐变一直在继续。由图10—11可知，枸杞酒陈酿过程中总糖呈不断下降趋势，还原糖先上升后波动下降。总糖发生酸水解使酒中多糖等非发酵性残糖转化为葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖等，使还原糖质量浓度有所升高，该还原糖参与美拉德反应被不断消耗，使还原糖、总糖曲线有所下降。

图10 陈酿过程中总糖、还原糖的变化Fig.10 Changes of total sugars and reducing sugars during wine aging

图11 陈酿过程中VC和5-HMF的变化Fig.11 Changes of VC and 5-HMF during wine aging

2.3 通径分析结果

通径分析是建立在通径系数概念基础上的一种多元统计分析方法[21]。以总酚（X1）、总糖（X2）、5-HMF（X3）、VC（X4）为自变量，以褐变度A420为Y值，进行通径分析。对褐变度进行S-W测试，统计量为0.934，p=0.583＞0.05，接近正态分布。采用逐步回归分析法，筛选出对褐变度影响显著的因素，得到最优回归方程：Y=5.809-0.853X1-0.667X2，由显著性检验可知：X1、X2显著性均小于0.05，且模型达极显著水平（F=266.498，p=0.000），相关系数R=0.996，说明方程拟合度达到99.6%，R2=0.993，剩余因子值很小，对褐变度有影响的自变量考虑较为全面。

由表4可知，总酚（X1）、总糖（X2）和VC（X4）与褐变度呈显著负相关，5-HMF（X3）与褐变度呈显著正相关。

表4 相关及显著性检验结果Table 4 Correlation and significance test results

由表5可知，总酚对枸杞酒褐变度的直接通径系数为P1=-0.682，对R2的总贡献为0.669，总糖对枸杞酒褐变度的直接通径系数P2=-0.345，对R2的总贡献为0.323，说明总酚、总糖对褐变度具有直接的负效应。可以看出，总酚对褐变度起直接作用，总糖对褐变度起间接作用。有研究表明，酸性环境中，糖类容易转变成羟甲基糠醛类中介物，然后与酚类物质反应生成有色物质，引起枸杞酒的褐变[22]。

表5 各褐变因素与褐变度通径分析表Table 5 Path analysis of browning factors and browning degree

2.4 模拟实验结果

2.4.1 不同酚类物质对褐变度的影响由图12可知，M3（芦丁）和M4（绿原酸）的褐变度明显高于M1（不含酚），20 d后褐变度分别为M1的1.67和1.28倍，M2（对羟基苯甲酸）的褐变度较M1无明显变化。芦丁和绿原酸是引起陈酿中非酶促褐变的主要物质。另外，有研究表明，多酚和赖氨酸、葡萄糖的交互作用能够促进褐变[23]，枸杞酒中有可能也发生了类似的反应。对羟基苯甲酸对枸杞酒陈酿中的褐变几乎无影响，其作为羟基苯甲酸衍生物，在陈酿过程中质量浓度的降低可能是与酒精结合所致[24]。

图12 不同酚类物质模拟体系褐变度的变化Fig.12 Changes of browning degree of different phenolic compounds model system

2.4.2 不同氨基酸对褐变度的影响由图13可知，M4（赖氨酸）和M5（脯氨酸）的褐变度高于M7（不含氨基酸），而M6（谷氨酸）褐变度在前5天达到最高后基本不变，明显低于M7，绿原酸、VC和葡萄糖的综合作用能明显促进褐变。脯氨酸是枸杞酒中质量浓度最高的氨基酸，对褐变具有明显促进作用，赖氨酸对枸杞酒褐变影响次之。谷氨酸在枸杞酒模拟体系中，对褐变度具有较明显抑制作用，其抑制机理有待研究。

图13 不同氨基酸模拟体系褐变度的变化Fig.13 Changes of browning degree of different amino acids model systems

3 结语

在发酵过程中，酶促褐变和非酶促褐变同时存在，酶促褐变主要由PPO和POD催化枸杞发酵液中的酚类物质引起。主要酚类物质是芦丁、绿原酸、羟基苯甲酸、阿魏酸、香豆酸，这些物质在酶的催化下形成具有高度氧化活性的邻醌，并最终形成不溶性的褐色多酚-黑色素，使枸杞酒的黄化发展为褐化。陈酿过程中，以非酶褐变为主，主要来自多酚的氧化缩合和美拉德反应。总酚、总糖、脯氨酸、赖氨酸和谷氨酸是引起褐变的主要原因。