基于网络药理学结合分子对接方法探讨绞股蓝治疗非小细胞肺癌的作用机制

陈江锋， 林芝娴， 韩孙亚， 郭勇

（1.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江杭州 310053；2.浙江中医药大学附属第一医院肿瘤科，浙江杭州 310006）

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，每年约有180万新诊断为肺癌的患者（约占全部癌症诊断病例的13%），估计死亡人数接近160万[1]。非小细胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌的85%，具有高转移率和高复发率[2]，大多数NSCLC患者就诊时已处于晚期，手术不适用，主要治疗手段为化疗和放疗。然而，几乎所有的放化疗都伴有严重的副作用，并且通常会降低患者的生活质量。为了提高NSCLC患者的临床疗效，减少副作用，有必要采取新的替代或辅助支持疗法。

绞股蓝Gynostemma pentaphyllum（Thunb.）Mak.为葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物，又名天堂草、七叶胆、五叶参等，主要分布于中国南部、日本、朝鲜和东南亚等地区。绞股蓝具有清热解毒、止咳化痰、补气生津、健脾安神的功效，被广泛用于治疗咳嗽、哮喘、慢性气管支气管炎、传染性肝炎及劳伤虚损等。此外，绞股蓝还被用于治疗肺癌、前列腺癌等，并可与其他中草药联用治疗更多不同类型的癌症[3-4]。现代药理研究表明，绞股蓝活性成分绞股蓝皂苷damulin A可通过诱导细胞凋亡，阻断G0/G1早期细胞周期，抑制细胞迁移，从而抑制肺癌细胞的生长[5]。阐明绞股蓝对NSCLC的潜在作用机制有重要价值。

中药具有多成分、多靶点、协同作用的特点，存在作用机制及作用成分不清等问题，较难通过传统的实验方法系统全面地检测出中药的确切作用机制。因此，有必要探索新方法来阐明中医药的科学依据和潜在作用机制。网络药理学综合了系统生物学、组学和计算生物学，是一种基于疾病、基因、蛋白靶点、药物相互作用网络的系统分析方法，从整体角度揭示了药物的作用机制，具有整体性、协同性和动态特性[6]，这些特点与中医整体理论的特点相一致。此外，分子对接基于网络药理预测与分析，利用高精度对接模拟和分子通路图表现配体的选择性，说明配体如何作用于复杂的分子网络，从而评估蛋白配体结合潜力[7]。因此，本研究采用网络药理学结合分子对接的方法探讨绞股蓝治疗NSCLC的作用机制，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 绞股蓝化学成分的收集及筛选 从TCMSP数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中收集了绞股蓝的化学成分数据，选择同时满足口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18的成分作为活性成分，然后通过Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索每一个活性成分的3D结构，剔除未能找到3D结构的活性成分，最后结果以mol2格式保存。

1.2 活性成分对应靶点库 通过TCMSP数据库、STITCH数据库（http：//stitch.embl.de/，V4.0）检索绞股蓝中活性成分靶点，其中，STITCH数据库检索条件物种设置为“Homo sapiens”，且置信度大于0.4，剔除没有相关信息的活性成分。将靶点输入到UniProt数据库（http：//stitch.embl.de），所选物种为“Homo sapiens”。剔除重复、非人和非标准靶点，通过检索和转化，最终得到绞股蓝活性成分对应的靶点库。

1.3 NSCLC相关靶点库的构建 以“non-smallcelllungcancer”或“NSCLC”为关键词在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org）、OMIM数据库（https：//omim.org）和 TTD 数 据 库（https：//db.idrblab.org/ttd/）中检索收集与NSCLC相关的靶点基因，去除重复基因，得到NSCLC相关靶点库。

1.4 蛋白相互作用网络构建与分析 为了进一步了解绞股蓝作用靶点和疾病靶点在蛋白水平上的作用机制，本研究将两者筛选得到的相关靶点库输入到Venny 2.1软件（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）以绘制Venny图，得到药物活性成分与NSCLC的交集靶点。再将其输入在线网站STRING 10.5（https：//string-db.org），蛋白类型设置为“Homo sapiens”，选取0.7的高置信度，其他参数设置为默认值，获取蛋白相互作用的关系。将导出文件中的node1、node2和combined score导入到Cytoscape软件中，绘制交互网络。设置节点大小以反映度值，边的粗细来反映combined score的大小，得到最终的蛋白相互作用网络图（proteinprotein interaction，PPI）。

1.5 分子对接 选择PPI中度值靠前的靶点蛋白，从RCSB蛋白数据库（https：//www.rcsb.org/）中获得上述靶蛋白的蛋白配体复合物，采用Systems Dock Web Site（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）对其与绞股蓝活性成分进行分子对接验证，评价绞股蓝活性成分与靶点之间的结合活性，并且筛选出潜在的核心化合物。

1.6 基因本体论（GO）生物过程和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将绞股蓝的作用靶点导入DAVID数据库（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/），限定物种为人，进行GO和KEGG通路分析，设定阈值P＜0.05，筛选排名靠前的生物过程或通路，利用Omishare Tools（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）对结果进行可视化。在KEGG数据库（https：//www.kegg.jp/）中搜索相关通路，联合Reactome数据库（https：//reactome.org/）加以注释，整合得到最终的通路图。

2 结果

2.1 绞股蓝活性成分的筛选 在TCMSP数据库中，根据OB≥30%和DL≥0.18筛选到24种化学成分，在Pubchem数据库中剔除未能找到3D结构的化学成分，在STITCH数据库中选择置信度＞0.7，剔除不含相关信息的化学成分后，最终筛选得到绞股蓝活性成分共8个，具体信息见表1。

2.2 活性成分对应靶点库和NSCLC相关靶点库的构建 通过TCMSP数据库、STITCH数据库检索绞股蓝中活性成分靶点，在UniProt数据库中进行转化，最终得到共84个对应靶点。通过检索GeneCards、OMIM、TTD数据库，删去重复靶点，共得到4 858个NSCLC相关作用靶点。

表1 绞股蓝中活性化合物的基本信息Table 1 Basic information of active compounds in Herba Gynostemmae Pentaphylli

2.3 蛋白相互作用网络构建 利用Venny 2.1软件将上述活性成分对应靶点及NSCLC相关作用靶点进行交互处理，得到交集靶点相关的Venny图（见图1）。将交集靶点输入String数据库中，限定物种为人，将结果导入Cytoscape软件得到靶点之间相互作用网络（见图2）。在图2中，节点代表蛋白，边代表蛋白之间的相关性。结果共涉及64个节点和249条边（RUNX1T1、HK2、ACHE、PRSS1、ACACA、PTGER3、EIF6因蛋白之间相关性较弱在图中未显示）。节点的大小表示度值的大小。节点越大，对应的度值越大。边的粗细和combined score相关，边越粗，combined score的值越大。其中，度值前4的蛋白分别为表皮生长因子受体（EGFR）（23）、细胞周期蛋白D1（CCND1）（22）、血管内皮生长因子A（VEGFA）（21）和雌激素受体1（ESR1）（21）。

图1 绞股蓝作用靶点和疾病靶点的Venny图Figure 1 Venny diagram of Herba Gynostemmae Pentaphylli action targets and disease targets

图2 绞股蓝靶蛋白的PPI网络Figure 2 PPI network of Herba Gynostemmae Pentaphylli target proteins

2.4 分子对接 在PPI分析中，度值越大意味着该节点在整个网络中占据重要地位。本研究选取上述度值前4位的蛋白与绞股蓝活性成分进行分子对接验证，结果详见表2。一般认为docking score值＞7.0表明活性成分与靶点具有强烈的结合活性，＞5.0表明两者有较好的结合活性，＞4.25表明有一定的结合活性[8]。分子对接结果表明，绞股蓝的活性成分与NSCLC相关靶点的结合性较好。制定2个筛选潜在核心化合物的标准：（1）与4个靶点对接，其中对接得分最高的化合物分别为：槲皮素（quercetin）（与VEGFA）、菠菜甾醇（spinasterol）（与CCND1）、谷甾醇（sitosterol）（与EGFR）、胆甾醇（CLR）（与ESR1）。将上述5对靶点化合物放入PyMOL软件中进行优化，具体对接蛋白与配体的相互作用如图3所示；（2）与4个重要靶点对接得分均＞5的化合物，满足这2个条件的化合物谷甾醇、菠菜甾醇、胆甾醇被认为可能是潜在的核心化合物。

表2 绞股蓝4个重要靶点的分子对接Table 2 Molecular docking of four important targets of Herba Gynostemmae Pentaphylli

2.5 GO和KEGG通路富集分析 通过DAVID数据库对上述交集靶点进行GO分析（见图4）和KEGG分析（见图5）。通过GO功能富集分析得到GO条目2 265个（P＜0.05），其中：生物过程（BP）条目1 921个，涉及细胞过程、代谢过程、生物调节、应激反应等方面；分子功能（CC）条目121个，涉及细胞组分、细胞、细胞器等方面；细胞组成（MF）相关的条目223个，涉及结合活性、催化活性、转录调节活性、分子功能调节等方面。通过KEGG通路分析（P＜0.05），排除广泛通路后，前20条信号通路如表3所示，主要涉及磷脂酰肌醇-3-羟激酶（PI3K）—苏氨酸激酶（Akt）信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、雌激素（Estrogen）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、低氧诱导因子1（HIF-1）信号通路等，提示绞股蓝治疗NSCLC的作用途径是多种多样的，这些通路之间存在着复杂的相互作用。在KEGG数据库中搜索前5条信号通路，联合Reactome数据库加以注释，整合得到最终的通路图（见图6）。

图3 绞股蓝4个重要靶点的对接分析Figure 3 Four important targets of Herba Gynostemmae Pentaphylli Docking analysis

图4 绞股蓝治疗NSCLC作用靶点的GO生物功能分析Figure 4 GO Biological function analysis of potential targets of Herba Gynostemmae Pentaphylli treatment for NSCLC

图5 绞股蓝治疗NSCLC作用靶点的KEGG富集气泡图Figure 5 Bubble diagram of KEGG enrichment of potential targets of Herba Gynostemmae Pentaphylli treatment for NSCLC

表3 绞股蓝治疗NSCLC作用靶点的KEGG通路分析Table 3 KEGG pathways analysis of potential targets of Herba Gynostemmae Pentaphylli treatment for NSCLC

图6 绞股蓝治疗NSCLC的潜在作用机制Figure 6 Potential mechanisms of Herba Gynostemmae Pentaphylli treatment for NSCLC

3 讨论

中医学认为非小细胞肺癌（NSCLC）属于“肺积”“肺岩”等范畴，正气虚损、痰瘀毒互结是其重要的病机。绞股蓝具有益气健脾、清热解毒、止咳化痰的功效，与NSCLC的病机相契合，既能清其毒化其痰，又能补其虚。然而，绞股蓝治疗NSCLC的具体作用机制至今仍未完全明确。

本研究利用网络药理学结合分子对接的方法探讨了绞股蓝治疗NSCLC的作用机制。在PPI中，EGFR、CCND1、VEGFA和ESR1的节点较大，推测这些节点可能是治疗NSCLC的主要靶点。EGFR是一种酪氨酸激酶受体，在细胞增殖、存活、迁移和凋亡等过程中发挥着重要作用，已被发现是参与NSCLC发生、发展的重要致癌因子，在亚洲患者中最为常见。EGFR在大多数NSCLC患者中过表达，是治疗的重要靶点[9-10]。CCND1是一种重要的致癌基因，通过促进细胞生长、迁移、侵袭和上皮间质转化（EMT）从而抑制包括肺癌在内的多种肿瘤细胞凋亡，具有很强的致癌能力[11-13]。肿瘤的生长伴随着血管生成的刺激，VEGF家族在肿瘤血管生成中起着重要作用，而VEGFA在其中起着主导作用[14]。VEGFA是目前发现的最有效的血管生成刺激因子之一，影响内皮细胞的血管通透性、增殖和活力，并被证明可以促进肺癌的进展[15-16]。ESR1定位于染色体6p25，属于转录激活因子超家族[17]。ESR1被证明具有抑制生长的功能。ESR1启动子高甲基化已被证明与许多癌症中基因转录的不可逆抑制相关，包括结肠癌、乳腺癌、颈癌和血液系统肿瘤[18-20]。最近，在肺癌细胞系以及肺癌标本中报道了ESR1的高甲基化[21]，并且有研究表明ESR1表达的缺失与肺癌中异常的5’CpG岛高甲基化有关[17]。

通过分子对接分析发现在8种绞股蓝活性成分中，谷甾醇、菠菜甾醇、胆甾醇可能是潜在的核心化合物。有研究表明谷甾醇具有抗肿瘤潜力，能够诱导肺癌A549细胞G0/G1细胞周期停滞从而抑制细胞增殖，抑制NSCLC异种移植肿瘤的生长，因此谷甾醇被认为是治疗NSCLC的新目标[22-23]。此外，菠菜甾醇在小鼠实验中显示出了抗肿瘤的潜力，它被发现对宫颈癌细胞株HeLa和RAW 264.7具有抗增殖活性[24-25]。另外，有研究表明胆甾醇的消耗增加了吉非替尼的敏感性，靶向胆甾醇与EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（TKI）结合可能成为吉非替尼耐药的NSCLC的新型治疗策略[26-27]。在3种潜在核心化合物中，菠菜甾醇对NSCLC的治疗尚未见报道，这可能是菠菜甾醇与NSCLC的相关性还尚未被研究，这为进一步研究绞股蓝治疗NSCLC的机制提供了理论参考。

DAVID通路注释分析结果显示，绞股蓝治疗NSCLC的潜在作用机制多集中在细胞增殖和抗炎作用。排名前5位的信号通路分别为PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Estrogen信号通路、TNF信号通路和HIF-1信号通路。与细胞增殖相关的信号通路有PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Estrogen信号通路、HIF-1信号通路等；与炎症反应相关的信号通路包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等。PI3K-Akt是最重要的信号传导通路之一，参与细胞增殖、细胞周期调控、凋亡等相关病理生理过程[28]。PI3K-Akt通路的失衡在肺癌的形成和发展中起着关键作用，其通路的激活可以激活多个下游信号的传导，促进NSCLC的发展[29]。因此，抑制PI3K-Akt信号通路的传导对NSCLC的治疗至关重要。MAPK调控细胞内信号通路，参与细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程与细胞恶性转化等病理过程，在NSCLC中扮演着重要角色[30]。MAPK的主要成分包括3个亚家族：生长因子反应通路，包括ERK1/2；2条应激反应通路，包括JNK/SAPK和p38MAPK。研究显示，ERK在NSCLC组织中异常表达或活性增强，表明ERK调控异常与肿瘤的发生、发展密切相关[31-32]；JNK通路主要在细胞增殖、凋亡及应激等多种生理病理过程中起重要作用[33-34]；p38被证实能够促进肺癌的发生、发展[35]。Estrogen已被证实具有增强肿瘤细胞恶性程度、刺激肿瘤细胞生长的作用[36-37]。它的生物学作用是通过2种雌激素受体（ESR）α和ESRβ来实现的[38]，其受体广泛存在于乳腺癌、子宫内膜癌、肺癌及正常肺组织中，可以调控细胞周期、控制细胞信号传导和影响细胞生存。目前普遍认为Estrogen及其受体系统与NSCLC的发生、发展具有一定的相关性[39]，Estrogen通路在NSCLC治疗中有着重要意义。TNF是一种直接杀伤肿瘤细胞的细胞因子，对正常细胞无明显毒性，它是目前发现杀死肿瘤的最活跃的生物活性因子之一。它通过与细胞膜上的特异性受体结合，促进细胞生长、分化、凋亡和诱导炎症[40]。TNF主要分为TNF-α和TNF-β。TNF-α是一种多效细胞因子，其与TNF受体相互作用，导致核因子κB（NF-κB）的立即激活和随后的细胞凋亡，TNF-α在细胞存活、细胞凋亡和炎症中扮演了重要的角色[41]。HIF-1是缺氧诱导的转录激活因子，是氧稳态和生理反应的调节因子[42]。HIF-1通过对血管重构和血管生成的影响来调节氧气的输送，并通过参与氧化还原稳态和葡萄糖代谢来调节氧的利用[43]。血管内皮生长因子（VEGF）的表达就由HIF-1α诱导，是血管生成最特异、最关键的调控因子之一，能够调节血管生成和血管通透性，在NSCLC的组织重塑和血管生成中发挥着重要作用[44-45]。因此，HIF-1信号通路可能与NSCLC的进展相关。

综上所述，本研究应用网络药理学和分子对接方法阐明绞股蓝可通过多化合物、多靶点、多通路作用于NSCLC。然而本研究基于数据分析对揭示其药理作用机制仅提供了理论参考，故仍需要通过进一步的体内外实验来验证我们的发现。