朱砂安神丸拮抗大鼠条件性恐惧及其睡眠障碍的作用

杨越赵航陈建宁李廷利

（黑龙江中医药大学中药药理教研室，黑龙江 哈尔滨150040）

恐惧是生物的一种基本感情，与生物的进化密切相关，它对人类的生存起到重要的作用，能够激发一系列的机体防御机制［1］。 研究表明，海马［2］、杏仁核复合体、外侧隔核、丘脑部分亚区［3］、导水管周围灰质［4］等皮层下结构及高级皮层前扣带回等为主要参与核团。

睡眠障碍与恐惧情绪之间往往是相互伴生。 条件性恐惧动物实验模型作为经典的恐惧情绪研究模型，源于巴甫洛夫经典条件反射，广泛应用于对恐惧的习得、表达、消退和复原的研究以及学习和记忆的神经机制研究。

朱砂安神丸首载于李杲的《内外伤辨惑论·卷中·饮食劳倦论》，由当归、甘草、黄连、地黄及朱砂组成［5］。 近年来研究表明，朱砂安神丸具有改善睡眠及治疗多种精神疾病的作用。 王莹等［6］的实验表明，朱砂安神丸可以促进恐惧的记忆消退。 还有促进恐惧记忆消退、保护海马神经元、增强海马神经元突触结构与功能的可塑性［7］。 但朱砂安神丸对条件性恐惧导致睡眠障碍的治疗研究较少。

本实验通过条件性恐惧习得、消退过程中实验动物的僵直时间和对恐惧习得和消退过程大鼠皮层脑电的描记，探究朱砂安神丸对条件性恐惧大鼠条件性恐惧习得和消退及在此过程中的觉醒-睡眠时间的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SD 大鼠，雄性，体质量（200±20）g，SPF 级，黑龙江中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（黑）2018-003。

1.1.2 仪器与试剂条件性恐惧实验监测系统（上海欣软信息科技有限公司，型号：XR-XC404-2）；条件性恐惧实验分析系统（上海欣软信息科技有限公司，型号：SuperFcs）；大鼠独立通气笼IVC（苏杭科技器材有限公司，型号：RU25H5）；朱砂安神丸（吉林省鑫辉药业有限公司，批号：20170701）

1.2 方法

1.2.1 朱砂安神丸的制备根据药品使用说明书得知成人服用最大剂量为9 g，根据体表面积折算法计算出大鼠的灌胃剂量0.81 g／kg，依据药物浓度及实验动物可服用剂量，确定给药量为0.9 mL／100 g。朱砂安神丸供试液配制方法：精密称取朱砂安神丸9.00 g，放置于研钵中，加入1%羧甲基纤维素钠（CMC）至朱砂安神丸悬浮，转移定容至100 mL 容量瓶中。

1.2.2 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧习得记忆的影响选取雄性SD 大鼠30 只，适应环境1 周后，随机分成空白组、模型组、给药组，每组10 只。 实验组实验动物灌胃给予朱砂安神丸7 d，空白组和模型组给予等量的1%CMC。 7 d 内每日灌胃1 次，给药时间在7：00—7：40 之间。 第7 日灌胃结束后，参照唐霜等［7］文章方法进行条件性恐惧模型的复制和条件性恐惧记忆习得测试，除空白组外各组实验动物均进行足底电刺激。

1.2.3 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧记忆消退的影响选取雄性SD 大鼠30 只，适应环境1 周后，随机分成空白组、模型组及给药组，每组10 只。 实验组灌胃给予朱砂安神丸7 d，空白组和模型组给予等量的1%的CMC。 模型复制的第2 天开始进行给药处理，连续6 d，每天灌胃1 次，给药时间为7：00—7：20 之间。 第2 天起，参照唐霜等［7］文章方法进行实验动物的恐惧记忆消退，恐惧记忆的消退在连续的6 d 内进行，每天1 次，消退时间在8：00—9：00之间进行。

1.2.4 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧习得过程觉醒-睡眠时间及睡眠时相的影响选取雄性SD 大鼠30 只，适应环境1 周后，随机分成空白组、模型组及给药组，每组10 只。 将各组实验动物进行皮层脑电及肌电电极埋置手术，术后将各组实验动物单笼饲养4 d。 之后进行药物干预处理，给药的第1 ～7 天对各组实验动物进行灌胃处理，给药时间在7：00—7：30。 在第7 天给药结束后进行条件性恐惧模型复制。 模型复制结束后将各组实验动物连接至16 道生理记录仪中，连续记录24 h。

利用Sleep Sign 软件进行数据分析，以每10 秒为1 帧，根据大鼠EEG 及EMG，以每4 小时为1 个单位对大鼠睡眠-觉醒进行分析。

根据大鼠EEG 及EMG 波形，将大鼠的睡眠-觉醒周期分为3 个阶段：

非快动眼（NREM）期：EMG 明显减弱，振幅较小；EEG 以纺锤波和低频高幅波形为主，大鼠行为表现为闭目，全身静卧不动，或埋头蜷身熟睡。 快动眼（REMS）期：EEG 表现为低幅高频信号的θ 波，EMG 消失。 觉醒（Wake）期：大鼠活动明显，EMG 波动较为剧烈，EEG 则以不规则的高频低幅信号为主。

1.2.5 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧记忆消退过程中觉醒-睡眠时间及睡眠时相的影响选取雄性SD 大鼠30 只，适应环境1 周后，随机分成空白组、模型组及给药组，每组10 只。 将各组实验动物进行皮层脑电及肌电电极埋置手术，术后将各组实验动物单笼饲养4 d。 之后将实验动物置于条件性恐惧刺激箱中，进行条件性恐惧模型复制。 模型复制的第2～7 天对各组实验动物进行灌胃给药，时间在7：00—7：30。 每天灌胃结束后，于8：00—11：00 将各组实验动物依次放入条件性恐惧刺激箱中进行条件性恐惧消退。 每天消退结束后将大鼠连接至16道生理记录仪中，连续描记皮层脑电12 h。

利用Sleep Sign 软件进行数据分析，以每10 秒为1 帧，根据大鼠EEG 及EMG，以每4 小时为1 个单位对大鼠睡眠-觉醒进行分析。

1.2.6 统计学处理采用SPSS 22.0 进行统计分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧记忆习得的影响

实验结果表明：与空白组相比，模型组条件性恐惧习得过程中，第1～5 个周期内僵直反应时间明显增加（P＜0.01），给药组与模型组在第1～5 个周期内的僵直反应时间无差异。 见图1。

图1 条件性恐惧习得过程中各组大鼠僵直反应时间Figure 1 Stiff reaction time of rats in each group during conditional fear acquisition

2.2 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧记忆消退的影响

实验结果表明：在条件性恐惧消退阶段，各组实验动物僵直反应时间随消退时间增加而逐渐减少；与空白组相比，模型组在第2 ～4 天僵直反应时间增加（P＜0.01）；第5 天模型组的僵直反应时间增加（P＜0.05）；与模型组相比，给药组在第4、5 天的僵直反应时间减少（P＜0.05）。 见图2。

图2 条件性恐惧记忆消退阶段各组大鼠的僵直反应时间Figure 2 Stiff reaction time of rats in each group in the phase of conditional fear memory fading

2.3 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧习得过程觉醒-睡

眠时间及睡眠时相的影响

2.3.1 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧习得过程中Wake 时间及百分比的影响

实验结果表明：与空白组相比，模型组在第1 ～3个周期，Wake 时间均有延长（P＜0.05）；与模型组比较，给药组在第1、2 个周期Wake 时间缩短（P＜0.05）。 与空白组相比，模型组在第1、2 个周期内，Wake 期百分率提高（P＜0.05）；在第3 个周期内，Wake 时间百分比增加（P＜0.01）；与模型组相比，给药组在第1～3 个周期Wake 时间百分比降低（P＜0.05）。见图3。

图3 条件性恐惧习得过程中各组大鼠Wake 时间及百分比Figure 3 Wake time and percentage of rats in each group during conditional fear acquisition

2.3.2 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧习得过程中睡眠总时间及百分比的影响

实验结果表明：与空白组相比，模型组在第1 ～3个周期内，睡眠总时间缩短（P＜0.01 或P＜0.05）；与模型组相比，给药组第1 ～3 个周期内的睡眠时间明显高于模型组（P＜0.01）；与空白组相比，模型组在第1～3 个周期内，睡眠时间百分比缩短（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组相比较，给药组第1～3 个周期内的睡眠时间百分比高于模型组（P＜0.05）。 见图4。

2.3.3 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧习得过程中REMS 时间及百分比的影响

实验结果表明：与空白组相比，模型组在第1 ～3个周期内，REMS 时间减少（P＜0.05）；与模型组相比，给药组在第2 个周期内，REM 时间明显增加（P＜0.01）；第1 个周期和第3 个周期内REM 时间增加（P＜0.05）；3 组实验动物REMS 时间百分比无明显变化。 见图5。

2.3.4 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧习得过程中NREM 时间及百分比的影响

实验结果表明：与空白组相比，模型组在第1 ～3个周期内，NREM 时间减少（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，给药组在第1～3 个周期内，NREM 时间差异无统计学意义；3 组实验动物NREM 时间百分比无明显变化。 见图6。

图4 条件性恐惧习得过程中各组大鼠睡眠总时间及百分比Figure 4 Total sleep time and percentage of rats in each group during conditional fear acquisition

图5 条件性恐惧习得过程中各组大鼠REMS 时间及百分比Figure 5 REMs time and percentage of rats in each groupduring conditioned fear acquisition

图6 条件性恐惧习得过程中各组大鼠NREM 时间及百分比Figure 6 NREM time and percentage of rats in each group during conditioned fear acquisition

2.4 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧消退过程中觉醒-睡眠时间及睡眠时相的影响

2.4.1 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧记忆消退过程中Wake 时间及百分比的影响

实验结果表明：与空白组相比，模型组在第2 ～4天，Wake 时间增加（P＜0.05）；与模型组相比，给药组实验动物在第4、5 天Wake 时间明显减少（P＜0.05）；与空白组相比，模型组在第2 ～4 天，Wake 时间百分比增加（P＜0.01）；在第5 天Wake 时间百分比增加（P＜0.05）；与模型组相比，给药组实验动物在条件性恐惧消退第4、5 天Wake 时间百分比明显减少（P＜0.05）。 见图7。

2.4.2 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧记忆消退过程中睡眠时间及百分比的影响

实验结果表明：与空白组相比，模型组在第2 ～4天，睡眠时间减少（P＜0.01）；第5 天睡眠时间减少（P＜0.05）；与模型组相比，给药组在第4、5 天睡眠时间增加（P＜0.05）。 与空白组相比，模型组在第2 ～4 天，睡眠总时间百分比降低（P＜0.01）；第5 天模型组睡眠时间百分比降低（P＜0.05）；与模型组相比，给药组实验动物在第4、5 天睡眠时间百分比增加（P＜0.05）。见图8。

图7 条件性恐惧记忆消退过程中各组大鼠Wake 时间及百分比Figure 7 Wake time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

图8 条件性恐惧记忆消退过程中各组大鼠睡眠时间及百分比Figure 8 Sleep time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

2.4.3 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧记忆消退过程中REMS 时间百分比的影响

实验结果表明：与空白组相比，模型组在第2～5天，REMS 时间均有减少（P＜0.05）；与模型组比较，给药组实验动物在第4 天REM 时间增加（P＜0.05）。见图9。 3 组实验动物REMS 时间百分比无明显变化。

2.4.4 朱砂安神丸对大鼠条件性恐惧记忆消退过程中NREM 时间及百分比的影响

实验结果表明：与空白组相比，模型组在第2～4天，NREM 时间明显减少（P＜0.01）；第5 天，NREM时间减少（P＜0.05）；与模型组相比，给药组在第4天，NREM 时间明显增加（P＜0.01），第5 天NREM时间增加（P＜0.05）。 见图10。 3 组实验动物NREM时间百分比无明显变化。

图9 条件性恐惧记忆消退过程中各组大鼠REMS 时间及百分比Figure 9 REMs time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

图10 条件性恐惧记忆消退过程中各组大鼠NREM 时间及百分比Figure 10 NREM time and percentage of rats in each group in the process of conditioned fear memory fading

3 讨论

恐惧是人们面临威胁性情境时的一种情绪反应，在恐惧条件反射和恐惧消除测试的早期阶段最明显，杏仁核储存恐惧记忆，并对厌恶经历期间储存于其他脑域的情感记忆进行调节。 即杏仁核神经元储存恐惧记忆并易化储存在其他脑域的恐惧记忆［8］。

条件性恐惧模型作为研究恐惧学习记忆的经典实验模型。 实验动物将中性刺激CS 出现后接着匹配厌恶性刺激US，多次训练后CS 转变为条件刺激，进而引发行为和生理上的反应。 睡眠障碍与恐惧情绪之间往往是相互伴生，创伤性事件造成的恐惧情绪会引发睡眠障碍，而睡眠障碍又会对恐惧情绪的习得和表达产生影响。 当恐惧情绪产生时，往往伴随着失眠或噩梦等。 因此可以推断，恐惧与睡眠障碍的神经生物学机制可能会有共同点。

有研究表明，外侧杏仁核内的去甲肾上腺系统参与了恐惧记忆的习得及巩固过程，通过阻断杏仁核内的β 受体可以破坏恐惧记忆的习得及巩固［9-10］。 研究表明，条件性恐惧可造成大鼠睡眠障碍，原因可能是条件性恐惧能够增强LC-NA 的活动，进而投射至杏仁核的NA 神经纤维直接激活杏仁核［11］。 LC-NA 神经不仅参与恐惧的消退，也参与恐惧的表达，过高的LC-NA 功能抑制前额叶皮质功能，减弱了消退过程中前额叶皮质对杏仁核的抑制，表现为恐惧表达增强［12］。

本实验研究表明，给药组表现为随消退时间增加，僵直时间逐渐减少，可能原因为朱砂安神丸可抑制LC-NA 神经功能，一方面可能通过抑制NA 神经的功能进而降低了NA 对前额叶皮质（PFC）的抑制作用［13］；另一方面恢复海马内受损的神经元，促进消退记忆写入前额叶皮质［14］，增强前额叶皮质对杏仁核的控制作用，减少了恐惧的表达；朱砂安神丸能提升恐惧习得后的睡眠时长，缩短睡眠障碍恢复时间，其原因可能是朱砂安神丸能抑制下丘脑室旁核（PVN），降低LC-NA 神经元的兴奋性，使睡眠障碍逐渐恢复。

综上所述，条件性恐惧能够引起觉醒时间延长，睡眠时间缩短而对REM 及NREM 的睡眠比例无影响；朱砂安神丸能够促进条件性恐惧消退；朱砂安神丸能够拮抗由条件性恐惧引起的睡眠障碍。 关于朱砂安神丸拮抗条件性恐惧引起的睡眠障碍的具体机制仍需要进一步研究。