高效毛细管电泳法同时分离测定化妆品中7种防腐剂

张 帅，高立娣*，梁 辉，秦世丽，蒋春红，段圣村，徐 蕾，林肖同，王媛媛

(1.齐齐哈尔大学 化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.生工生物工程(上海)股份有限公司，上海 201611；3.上海百雀羚日用化学有限公司，上海 200040)

众所周知，微生物无处不在，在化妆品的生产和使用过程中亦不可避免的会有微生物侵入，使化妆品腐败变质，保质期缩短，有效成分降低，甚至威胁使用者的身体健康，所以需要在化妆品中加入一类能防止由微生物引起这一系列不良影响的添加剂——防腐剂[1]。市面上常用的化妆品防腐剂多为化学合成品，其产量大，生产成本低，使用方便简单。但当其使用量大，使用不当或者长时间使用时，会产生较大的不良反应，对身体产生一定的危害，严重者甚至可能导致癌变[2]。我国已对其使用量制定了严格的限制标准[3-4]，但还未出台相应的国家标准。因此，建立一种快速、高效、准确的分离测定化妆品中防腐剂的方法非常必要。目前报道的化妆品中防腐剂的检测方法有高效液相色谱法[5-6]、气相色谱法[7-8]、气相色谱-质谱法[9-11]和毛细管电泳法[12]等。相对于传统的高效液相色谱法和气相色谱法，毛细管电泳法有效改善了高效液相色谱法的色谱柱价格昂贵，气相色谱法分析周期长、样品前处理繁琐等缺陷[13-14]，具有快速、简单、灵敏等优点。但目前为止，该方法用于化妆品中防腐剂的检测鲜见报道。

本文以磺丁基-β-环糊精为添加剂，磷酸盐为缓冲溶液，建立了毛细管电泳法同时分离检测7种防腐剂(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯苯甘醚、辛酰羟戊酸、脱氢乙酸钠)的方法。优化了添加剂的种类与浓度、磷酸盐缓冲液pH值及分离电压，并对市售化妆品中的防腐剂含量进行了分离检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效毛细管电泳仪(美国Agilent公司)，GWA-UN5系列超纯水器(北京普析通用仪器有限责任公司)。对羟基苯甲酸甲酯(99.5%)、对羟基苯甲酸乙酯(99.5%)、对羟基苯甲酸丙酯(99.5%)、对羟基苯甲酸丁酯(99.5%)购自吉林化工有限公司；氯苯甘醚(98%)、辛酰羟戊酸(99.8%)购自天津凯莱试剂厂；脱氢乙酸钠(99.6%)、磺丁基-β-环糊精(98%)购自北京华威瑞科化工有限公司。化妆品(护手霜)购自超市。所有溶液均经0.45 μm微孔滤膜过滤后使用，实验用水均为超纯水。

1.2 实验方法

石英毛细管(内径50 μm，总长38 cm,有效长度32 cm，美国Agilent公司)，采用含10 mmol/L磺丁基-β-环糊精的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠混合体系(pH 8.0)为缓冲液，分离电压为20 kV，柱温15 ℃，检测波长280 nm，压力进样5 kPa×3 s。首次进样前依次用1.0 mol/L NaOH、水及缓冲溶液冲洗毛细管3、1、3 min。

分别称取0.010 g对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯苯甘醚、辛酰羟戊酸、脱氢乙酸钠用甲醇溶于50 mL容量瓶，得到200 mg/L的标准储备液。再将标准储备液逐级稀释得到100、50、30、10、5 mg/L的标准使用液。

1.3 样品处理

分别取0.100 g护手霜和卸妆膏于烧杯中，各加入50 mL甲醇，取5 mL保湿水于烧杯中，加入50 mL甲醇，超声20 min后，在5 200 r/min下离心5 min后，进样检测。

2 结果与讨论

2.1 电泳条件的优化

2.1.1 添加剂种类与浓度的优化环糊精可与客体分子通过氢键、疏水键等形成主客体包合体系。样品中的各组分通过与β-环糊精或环糊精衍生物形成稳定常数不同的包合物,导致其在毛细管内迁移时间不同,从而达到不同的分离效果。实验以100 mg/L的标准溶液为分析对象，考察了β-环糊精及磺丁基-β-环糊精作为添加剂对分离的影响。结果表明，在所考察条件下，改变β-环糊精浓度未能明显改善分离效果。采用分离电压15 kV，pH 8.0，进一步考察了不同浓度磺丁基-β-环糊精对分离效果的影响。结果显示，磺丁基-β-环糊精可改善7种防腐剂的分离效果，但当磺丁基-β-环糊精浓度分别为5 mmol/L 和15 mmol/L时，脱氢乙酸钠和对羟基苯甲酸甲酯无法完全分离，当其浓度为10 mmol/L时，7种待测组分在8 min内达到基线分离(见图1)。因此实验选择10 mmol/L的磺丁基-β-环糊精作为添加剂分离7种防腐剂。

图1 磺丁基-β-环糊精浓度对7种防腐剂分离效果的影响

2.1.2 磷酸盐缓冲液pH值的选择运行缓冲液的pH值会直接影响毛细管的Zeta电位，进而影响电渗流，同时缓冲液的pH值也决定样品中各组分的带电情况，从而影响其迁移时间和分离效果。实验考察了pH值分别为6.0、7.0、8.0、9.0时,7种防腐剂的分离效果(表1)。结果显示，随着缓冲液pH值的增大，迁移时间逐渐缩短，组分间的分离度先增大后减小。当pH=6.0、7.0时，脱氢乙酸钠和对羟基苯甲酸甲酯未达到基线分离，分离度Rs分别为0.85和0.92；当pH 8.0时，各组分的分离度增大，7种防腐剂均达到基线分离(Rs=1.69～2.40)；pH 9.0时，虽然7种组分也能分开，迁移时间更短，但分离度降低(Rs=1.60～1.92)。因此，综合考虑，后续实验选择缓冲溶液的最佳pH值为8.0。

表1 磷酸盐缓冲液pH值对7种防腐剂分离的影响

*the alphabet(a-g) denoted was the same as that in Fig.1

图2 分离电压对7种防腐剂分离的影响

2.1.3 分离电压对分离的影响分离电压影响迁移时间和分离度的大小。实验考察了7种防腐剂在分离电压分别为15、20、25 kV条件下的分离情况(见图2)。结果显示，随着分离电压的增加，各组分的迁移时间逐渐缩短，但分离度有所下降。当电压为15 kV和20 kV时，7种防腐剂均基线分离(Rs=1.63～2.40)，但20 kV时7种防腐剂的迁移时间较短(5 min)，分离效率更高。当电压达到25 kV时，辛酰羟戊酸和氯苯甘醚的分离度降低(Rs=1.42)，无法完全分离，且基线变差。因此，实验选择20 kV为最佳分离电压。

2.2 标准曲线、检出限与重现性

在优化条件下，取配制的7种防腐剂标准溶液系列浓度(5、10、30、50、100、200 mg/L)依次进样分离检测，以峰面积(y)对各组分标准溶液的质量浓度(x,mg/L)绘制标准曲线，计算线性方程和相关系数。选取5 mg/L的标准溶液，在最佳电泳条件下重复检测7次，计算所得峰面积的标准偏差(SD)，以及迁移时间与峰面积的相对标准偏差(RSD)，根据MDL(方法检出限)=SD*t(n-1)(n=7时的自由度)获得方法检出限。结果表明：7种防腐剂在5～200 mg/L的质量浓度范围内与峰面积间呈良好的线性关系，相关系数为0.990 7～0.998 9，检出限为1.23～4.30 mg/L；该方法的重现性良好，迁移时间和峰面积的RSD分别不大于1.3%和6.0%(见表2)。

表2 7种防腐剂的线性范围、相关系数、方法检出限及其迁移时间与峰面积的相对标准偏差

2.3 加标回收率与相对标准偏差

某市售护手霜样品、卸妆膏样品分别称取两份0.100 g，保湿水样品量取5 mL，各溶于50 mL甲醇中，分别加入对应含量的标准品，平行测定5次，计算加标回收率(见表3)。结果表明，各组分的平均回收率为95.4%～103%，RSD不大于4.8%。说明本方法准确可靠，可以用于化妆品中该7种防腐剂的检测。

表3 7种防腐剂的加标回收率与相对标准偏差(n=5)

*no detected

2.4 实际样品的分析

对市售的其它某品牌护手霜、卸妆膏、保湿水中所含防腐剂进行分离检测，按照“1.2”将样品进行简单预处理后，在所建立的优化条件下对各样品进行检测，结果见图3。其中护手霜中检出3个峰，分别为对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、未知组分峰(图3A)。卸妆膏中共检出4个峰，分别为氯苯甘醚、脱氢乙酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、未知组分峰(图3B)。保湿水中检出2个峰，分别为辛酰羟戊酸、未知组分峰(图3C)。经计算，该护手霜中对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯的含量分别为0.39%和0.23%；该卸妆膏中，氯苯甘醚的含量为0.03%，脱氢乙酸钠的含量为0.11%，对羟基苯甲酸甲酯的含量为0.19%；该保湿水中的辛酰羟戊酸的含量为0.02%。对羟基苯甲酸甲酯及脱氢乙酸钠含量符合我国卫生部《化妆品卫生规范》对这些防腐剂的限量要求，即单一酯的最大允许用量为0.4%，混合酯为0.8%，脱氢乙酸钠为0.6%。

2.5 与其他方法的比较

将本方法与已有报道的检测防腐剂的方法进行比较。结果显示，毛细管电泳法分离化妆品中防腐剂，可在10 min内检测分离氢醌、苯酚等4种防腐剂，回收率为93.2%～110%[12]；传统的高效液相色谱法分离化妆品中防腐剂，其样品预处理方法需经过一定比例的甲醇和水溶解、萃取、超声、离心等操作，分离时间长(40 min)，且部分组分间的分离度较低，定量困难，柱效较低[15-16]。而本方法可在5 min内同时分离检测7种化妆品中的常用防腐剂，回收率为95.4%～103%，回收率范围更准确，对样品预处理仅需甲醇溶解、超声、离心即可，样品预处理方法更简便，分离时间更短，分离效率更高，分离度更大，定量准确且进样量少。

图3 实际样品的测定结果

3 结 论

本文建立了一种同时分离检测化妆品中7种防腐剂的毛细管电泳方法。在20 mmol/L磷酸盐-10 mmol/L磺丁基-β-环糊精(pH 8.0)为缓冲溶液，分离电压20 kV的优化条件下，7种防腐剂在5 min内达到基线分离。研究结果表明，该方法简单快速，准确度和灵敏度高，重现性好，可为化妆品中防腐剂的分离分析提供参考，同时也可为制订化妆品中防腐剂检测的国家标准提供数据。