手性共价有机骨架材料CTpPa-1用于HPLC固定相拆分手性化合物

余云艳，袁宝燕，许娜艳，章俊辉，富 楠，谢生明，袁黎明

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

共价有机骨架材料(Covalent organic frameworks,COFs)是近年来研究较多的一类新型有机多孔晶体材料，以轻质元素C、O、N、B、H、Si等通过共价键连接，形成具有周期性结构的多孔骨架[1-2]。COFs作为一类新型的多孔材料，具有低密度、永久的孔隙结构、大比表面积、良好的溶剂稳定性和热稳定性等优点，在气体吸附、传感、催化、储存和光电化学等许多领域具有良好的应用前景[3-9]。

近年来，COFs在色谱分离领域的应用受到了广泛关注。目前，已有少量COFs材料被成功用于气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电色谱(CEC)，如将TpBD[10]、LZU-1[11]、TpPa-1[12]、COF-5[13]和手性COFs[14-16]等作为色谱固定相用于同系物、位置异构体、外消旋化合物的分离。2016年，严秀平团队[14]将手性COFs材料CTpPa-1用作气相色谱固定相制得毛细管手性柱，该柱对手性化合物(1-苯基乙醇、1-苯基-1-丙醇、柠檬烯和乳酸甲酯)表现出良好的对映选择性和拆分能力。随后，章伟光课题组[15]构建了一种新型手性COFs材料BtaMth@SiO2，并将其作为固定相制备了高效液相色谱柱，该柱对硝基甲苯、硝基氯苯等位置异构体以及β-氯氰菊酯、叶菌唑等顺反异构体具有高分辨的分离性能，但未用于拆分手性化合物。2018年，崔勇课题组[16]首次报道了将一种3D手性COFs材料CCOF-6用于高效液相色谱手性分离的研究，1-苯基-2-丙醇、1-苯基-1-戊醇、1-苯基-1-丙醇、1-(4-溴苯)-乙醇在该手性柱上实现了基线分离。可见，手性COFs材料在手性分离领域具有广阔的应用前景。

通过醛基和胺缩合的席夫碱反应制备的COFs材料具有良好稳定性，适合用作色谱固定相[17]。本文以合成的CTp为手性有机单体，将其与对苯二胺(Pa-1)发生席夫碱反应合成手性COFs材料CTpPa-1[14]。制备的CTpPa-1呈现蓬松的絮状，其骨架密度为1.53 g·cm-3，但纯CTpPa-1材料不适合直接装柱。随后将CTpPa-1与C18球形硅胶混合作为固定相成功制备了高效液相色谱柱。考察了该CTpPa-1手性柱的手性识别性能，将不同类型的手性化合物作为测试样品在CTpPa-1手性柱上进行分离实验。该手性柱对醇类、酮类、酚类、有机酸类、胺类等18种手性化合物实现了不同程度的拆分，对位置异构体(硝基苯酚、溴苯胺、二硝基苯)也具有一定的分离能力。表明手性COFs材料作为固定相有望在高效液相色谱领域得到应用。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

六亚甲基四胺(纯度98%，天津Alfa Aesar化学有限公司)；无水间苯三酚(纯度99%，上海Aladdin生化科技股份有限公司)；(+)-二乙酰基-L-酒石酸酐(上海TCI化成工业发展有限公司)；对苯二胺(Pa-1，纯度99%)和三氟乙酸(纯度99%)均购于上海Adamas-beta试剂公司；C18球形硅胶(孔径120 Å，粒径5 μm，碳载量17%)购于美国Sepax Technologies公司；四氢呋喃(分析纯，天津市光复精细化工研究所)；浓盐酸(昆明市嵩明县杨林工业开发区)；无水硫酸镁、二氯甲烷、无水乙醇、正己烷和异丙醇均为分析纯，购于天津风船化学试剂科技有限公司；位置异构体购于上海Adamas公司；手性化合物购自日本TCI公司和美国Fluka公司；去离子水由ELGA LabWater纯水机制备。

EClassical 3100型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)，配有P3100高压恒流泵和UV3100紫外-可见检测器；由iChrom W5100液相色谱工作站进行仪器控制和数据采集；色谱柱由O3100色谱柱温箱控制柱温；高压匀浆法液相色谱装柱机(深圳市正大流体机电设备有限公司)；不锈钢液相色谱空柱(250 mm×2.1 mm i.d.，美国Alltech公司)；粉末X射线衍射仪(Rigaku公司)；Magna-560傅立叶变换红外光谱(FTIR，4 000～400 cm-1，Nicolet，Madison，WI)；S-3000N型扫描电子显微镜(日本Hitachi Science Systems公司)；BELSORP-max型全自动比表面积和孔径分析仪(日本麦奇克拜尔有限公司)；FA2204B型分析天平(上海精科天美仪器有限公司)；50 mL比重瓶(江苏华鸥玻璃有限公司)；科伟DZF型真空干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)；安科OSB-2100旋转蒸发仪(上海泉杰仪器有限公司)；ELGA-LC134纯水机(英国ELGA公司)。

1.2 Tp的合成

参照文献[18]合成1,3,5-三甲酰基间苯三酚(Tp)：称取六亚甲基四胺(15 g，108 mmol)和无水间苯三酚(6 g，49 mmol)，混合均匀后加入500 mL两颈圆底烧瓶内，N2保护下向其中缓慢加入90 mL三氟乙酸，边加边搅拌。混合溶液在100 ℃油浴锅中加热回流2.5 h后，向烧瓶内加入150 mL 0.3 mol/L的盐酸，继续反应1 h后停止加热。当温度降至室温时，用砂芯漏斗抽滤除去滤渣，取下层液体于1 000 mL分液漏斗中，加入350 mL二氯甲烷萃取3次。有机相用无水MgSO4干燥，过滤，滤液旋干后得到粉白色的固体。

1.3 CTp的合成

参照文献[14]合成CTp：取合成的Tp(0.3 g，1.5 mmol)与(+)-二乙酰基-L-酒石酸酐(3.8 g，18 mmol)分别超声分散于150 mL无水四氢呋喃中，在N2保护下，将Tp的分散液逐滴加至(+)-二乙酰基-L-酒石酸酐的分散液中，超声混合均匀，混合物在60 ℃回流24 h。冷却至室温后，向其中加入10 mL水搅拌延缓反应，滤液旋干，得到黄绿色残渣。用蒸馏水洗涤残渣，真空干燥得CTp。

1.4 手性COFs材料CTpPa-1的合成

参照文献[14]合成手性COFs材料CTpPa-1：称取合成的CTp(0.095 g,0.1 mmol)和Pa-1(0.016 g,0.15 mmol)溶解于18 mL无水乙醇和2 mL无水四氢呋喃的二元混合溶剂中，冰浴中超声分散10 min，将获得的混合物移至带有冷凝管的三颈烧瓶中，在氮气保护、80 ℃下回流4 h，冷却至室温。用无水四氢呋喃和无水乙醇洗涤3次，得到土黄色的沉淀物，于120 ℃下真空干燥24 h得到CTpPa-1(77.5 mg)，产率为76%。

1.5 手性固定相的制备

依次称取0.6 g CTpPa-1、0.6 g C18球形硅胶于50 mL小烧杯中，通过搅拌和超声的方法将两者按1∶1(质量比)混合均匀，作为固定相备用。

1.6 CTpPa-1色谱柱的填装

采用高压匀浆法进行液相色谱柱的填装，称取“1.5”中制备的固定相1.2 g于50 mL小烧杯中。加入36 mL正己烷-石蜡(9∶1,体积比)溶液配成悬浮液，然后迅速将其倒入匀浆罐中，以正己烷-异丙醇(9∶1,体积比)作为顶替液，以35～40 MPa的N2压力装柱5 min后，将N2压力缓慢降至20～25 MPa再装柱30 min。以0.1 mL/min流速将填充好的手性CTpPa-1色谱柱用正己烷-异丙醇(9∶1)冲洗2 h，基线平稳后进行色谱分离实验。

图1 CTpPa-1的PXRD图

1.7 色谱分离条件与性能评价参数

将位置异构体和手性化合物分别用无水乙醇和正己烷-异丙醇(9∶1)溶解，配制成质量浓度约为50 μg/mL的标准溶液，经滤膜过滤和超声脱气后进样检测，每次进样量为5 μL。分别配制不同体积比的正己烷-异丙醇(99∶1、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30)作为流动相，溶剂在配制流动相前用0.45 μm有机滤膜过滤并超声脱气10 min；流速为0.1 mL/min；柱温为25 ℃；检测波长为254 nm。

采用保留因子(k)、分离因子(α)、分离度(RS)作为该CTpPa-1手性柱的色谱拆分性能评价参数。计算公式分别为：k=(t1-t0)/t0，α=k2/k1，RS=(t2-t1)/[W1/2(1)+W1/2(2)]，其中t0为色谱柱的死时间，采用1,3,5-三叔丁基苯测得;t1和t2分别为第1个流出峰和第2个流出峰的保留时间;W1/2(1)和W1/2(2)分别表示两个峰的半峰宽。

图2 CTpPa-1的红外光谱图

图3 固定相的扫描电镜图

2 结果与讨论

2.1 手性COFs CTpPa-1的表征

对合成的手性COFs CTpPa-1进行粉末X射线衍射(PXRD)表征，并与文献[14]进行了对比。由图1可见，合成的手性COFs CTpPa-1在4.8°左右出现1个强峰，8.1°附近和25.8°附近出现2个较弱的信号峰，其主要衍射峰与文献报道的模拟和实验PXRD衍射峰的位置及强度基本保持一致，表明已成功合成手性COFs CTpPa-1。

将合成的手性COFs材料与C18硅胶混合作为固定相制备HPLC柱。图3为手性COFs CTpPa-1固定相的扫描电镜(SEM)图。由SEM图可知，C18硅胶和CTpPa-1混合较均匀。

在77 K条件下测试了CTpPa-1的氮吸附-脱附等温线(图4A)，得到其孔容为0.37 cm3·g-1。由图4B可知，该材料存在3个区域的孔径分布，分别在1.3、2.2、3.0 nm左右，用非定域密度函数理论(NLDFT)计算得到其孔径主要集中在1.3 nm[14]，其骨架密度为1.53 g·cm-3。

图4 CTpPa-1的氮吸附-脱附等温线(A)与孔径分布(B)

2.2 CTpPa-1手性柱的分离性能研究

2.2.1 外消旋化合物的拆分采用不同比例的正己烷-异丙醇作为流动相，考察了CTpPa-1手性柱的手性识别能力，对一系列外消旋化合物进行手性拆分。结果表明，该固定相具有良好的手性识别能力，有18种手性化合物实现了不同程度的拆分(见表1)。18个手性化合物在CTpPa-1手性柱上的分离色谱图见图5。

表1 外消旋化合物在CTpPa-1柱上的拆分

图5 外消旋化合物在CTpPa-1柱上拆分的HPLC色谱图

由表1可知，1,2-二苯基乙二醇、1-(4-氯苯基)乙醇、1-(9-蒽基)-2,2,2-三氟乙醇、二苯基乙醇酮、吡喹酮、盐酸普萘洛尔、吲哚洛尔、盐酸克伦特罗、酮洛芬、布洛芬、氨氯地平、奥美拉唑等12种手性化合物在CTpPa-1手性柱上实现了较好的拆分，有5个手性化合物达到基线分离，7种手性化合物接近基线分离，最大分离度达3.65。该手性柱对醇类、酮类、酚类、有机酸类、胺类等化合物有较好的手性拆分能力。此外，将手性CTpPa-1柱(A柱)与手性COF柱(CCOF-6柱)、手性MOF柱(B柱)和商品AD柱(C柱)的手性拆分能力进行了对比。其中，CCOF-6柱仅对手性醇类表现出良好的拆分性能[16]。在被拆分的18种手性化合物中，有9种手性化合物在手性MOF柱[19](B柱)上未得到拆分，但在A柱上得到了较好的拆分，分别为1-(9-蒽基)-2,2,2-三氟乙醇、吡喹酮、吲哚洛尔、美托洛尔、盐酸克伦特罗、马来酸氯苯那敏、3,5-二硝基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺、氨氯地平和奥美拉唑，然而B柱对华法林、1,1′-联-2-萘酚等有较好的拆分效果；有6种手性化合物在商品AD柱[20](C柱)未得到拆分，分别为氧氟沙星、1,1′-联-2-萘酚、美托洛尔、盐酸克伦特罗、布洛芬、氨氯地平。另外，部分手性化合物在A柱上的分离因子高于C柱。通过对比研究发现，不同类型的手性固定相表现出不同的手性识别能力，具有明显的手性拆分互补作用。

手性CTpPa-1固定相对多种不同类型的手性化合物表现出一定的拆分能力，其手性分离机理比较复杂。手性识别能力主要与晶体的结构及其手性微环境有关，本文采用“bottom-up strategy”方法先将Tp与(+)-二乙酰基-L-酒石酸酐功能化，形成手性功能化单体CTp，再通过CTp上的醛基与Pa-1上的氨基缩合成亚胺键以形成具有二维重叠层状结构的CTpPa-1。因此CTpPa-1骨架结构中的羧基和亚胺存在氢键受体或供体，易于形成氢键作用；酯基存在较强的偶极作用；骨架中的苯环能与含苯环结构的手性化合物发生π-π相互作用。外消旋化合物在CTpPa-1中可能存在多种对映体选择识别机制，如手性立体匹配、氢键、偶极-偶极作用、π-π相互作用和范德华力等。例如，手性COFs CTpPa-1固定相对醇类化合物的拆分效果较好，表明醇的羟基与CTpPa-1亚胺中的氮原子之间存在的氢键对于手性识别起着重要作用。

2.2.2 位置异构体的分离采用不同比例的正己烷-异丙醇作为流动相，考察了CTpPa-1柱对位置异构体的分离能力。由表2和图6可知，硝基苯酚、溴苯胺、二硝基苯3种位置异构体在CTpPa-1柱上得到了不同程度的分离。

表2 3种位置异构体在CTpPa-1柱上的分离

图6 位置异构体在CTpPa-1柱上的HPLC分离谱图

Fig.6 HPLC chromatograms for separation of positional isomers on the CTpPa-1 column

A：o,m,p-nitrophenol，B：o,m,p-bromoaniline，C：o,m,p-dinitrobenzene；mobile phase：hexane-isopropanol(Table 1)；flow rate:0.1 mL·min-1;UV:254 nm

2.3 CTpPa-1手性柱的重现性与稳定性

在流速为 0.1 mL/min，检测波长为 254 nm条件下，选用1-(4-氯苯基)乙醇和吲哚洛尔考察了CTpPa-1手性柱的重现性。结果表明，以正己烷-异丙醇(95∶5)为流动相，该柱经历了50、100、150、200、250次连续进样后，1-(4-氯苯基)乙醇的色谱拆分效果基本保持不变(图7A)，连续取样多次后，样品的洗脱时间也无明显变化，其样品的保留时间与峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.86%和1.1%；以正己烷-异丙醇(80∶20)为流动相，用3个批次的CTpPa-1柱对吲哚洛尔进行重现性分析，样品的保留时间无明显改变(图7B)。实验结果表明，该手性柱在色谱分离过程中具有良好的重现性和稳定性。

图7 1-(4-氯苯基)乙醇(A)和吲哚洛尔(B)的重现性色谱图

3 结 论

本文按文献合成了一种二维重叠层状结构的手性COFs材料CTpPa-1，将其与C18硅胶混合用作高效液相色谱固定相制备成手性柱，并对多种不同类型的手性化合物进行分离测试。实验结果表明，在正己烷-异丙醇流动相体系下，制备的手性COFs柱对醇类、酮类、酚类、有机酸类、胺类等18种外消旋化合物表现出较好的手性拆分能力，对一些位置异构体(硝基苯酚、溴苯胺、二硝基苯)也具有一定的分离能力。因此，该手性COFs材料CTpPa-1作为新型高效液相色谱固定相分离外消旋化合物有一定的研究意义，拓展了手性COFs在高效液相色谱分离领域中的应用。