气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定发酵乳中4种糠醛类物质

崔钰莹，于欣楷，章 航，梁鹏宇,崔 鼎，徐 童，杜振霞*，谢云峰

(1.北京化工大学 化学学院，北京 100029；2.中粮营养健康研究院 营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京 102209)

食品工业一直努力改善乳制品风味，为消费者提供多重选择。乳品经煮开后自然发酵产生的发酵乳种类丰富，风味独特，更易被人体吸收利用[1-2]。然而，在热处理过程中易发生一种普遍的非酶褐变现象(即美拉德反应)，该反应会产生抗营养和有毒化合物，并改变发酵乳的感官和功能特性[3]。炭烧风味发酵乳在发酵的基础上进行长时间低温烤制，使牛奶中的乳糖焦糖化，美拉德反应充分，自然形成褐色酸奶，口感焦香浓郁[4-6]。美拉德反应诱导产生的羟甲基糠醛(5-HMF)是衡量反应程度的重要指标，其经水解可产生糠醛(F)、甲基糠醛(MF)、2-乙酰基呋喃(FMC)，是美拉德反应的晚期产物[7]。据报道，此4种糠醛类物质均有不同程度的毒性，对人体健康具有潜在危害[8]。因此，发酵乳的营养价值及质量问题备受消费者和科研工作者关注。

目前，国内外报道了很多用于分离分析牛乳、蜂蜜、调味品、饮料和酒类中糠醛类物质的方法[9-15]，如刘畅等[16]采用HPLC法检测褐色酸奶中5-羟甲基糠醛；林晓珊等[17]利用GC-MS/MS快速测定了调味品中3种糠醛类物质；孙瑶等[18]应用一种基于氮酮形成的柱前荧光衍生化方法测定牛奶粉和葡萄干中的羟甲基糠醛、糠醛、甲基糠醛、2-乙酰基呋喃。然而，对发酵乳中上述4种糠醛类物质同时检测的方法尚未见报道。本研究建立了一种发酵乳中上述4种糠醛类物质同时检测的GC-MS/MS方法，采用QuEChERS前处理技术[19-20]，有效降低了基质干扰，操作简单，灵敏度高，重现性好，是一种快速有效的检测方法。通过该方法可判断发酵乳生产工艺对其糠醛危害物产生量的影响，进而为消费者提供合理的选购建议与指导，具有一定的创新性和实用价值。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo TQS8000气相色谱-三重四极杆串联质谱仪(赛默飞公司)，配RTX-WAX色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；MX-S涡旋振荡器(万顺仪器公司)；SB-3200DTDN超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；RJ-2GL-1850台式高速离心机(无锡市瑞江分析仪器有限公司)；0.22 μm有机滤膜(安捷伦公司)。

羟甲基糠醛(5-HMF)、糠醛(F)、甲基糠醛(MF)、2-乙酰基呋喃(FMC)标准品(纯度≥99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司);乙腈(色谱纯，Fisher Chemical公司)；氯化钠、无水乙酸钠、无水硫酸镁(分析纯，国药集团)；C18、PSA(Agela Technologies公司)。

1.2 标准溶液配制

标准储备液：准确称取1.00 mg 4种糠醛标准品溶于1 mL甲醇(色谱纯)溶液中，分别配成质量浓度为1.0 mg/mL单标贮备液，-20 ℃保存，备用。

标准工作液：使用甲醇(色谱纯)溶液配制质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L的4种糠醛的混合标准工作溶液。

1.3 样品前处理

准确称量1.0 g(精确至0.000 1 g)样品，加入2 mL乙腈、0.6 g氯化钠(NaCl)和0.2 g无水乙酸钠(NaAc)盐析破乳，充分涡旋2 min，超声20 min，再加入0.6 g无水MgSO4除水，放入高速冷冻离心机中以6 000 r/min离心5 min，取1 mL上清液加入40 mg C18、10 mg PSA和100 mg无水MgSO4净化，涡旋，静置，过0.22 μm PTFE膜，滤液上机测试。

1.4 色谱-质谱条件

气相色谱条件：色谱柱RTX-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为氦气(He)，碰撞气为氩气(Ar)，进样口温度250 ℃，恒流模式，柱流量1 mL/min，升温程序：初始温度60 ℃，保持2 min，以20 ℃/min升至120 ℃，再以10 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。

三重四极杆质谱条件：电离方式为电子轰击源(EI)，传输线温度为280 ℃，离子源温度为300 ℃，电离能量为70 eV，多反应监测(MRM)模式。4种糠醛类化合物的保留时间、离子信息及碰撞能量见表1。

表1 4种糠醛类化合物的保留时间、离子对以及碰撞能量

*quantitation ion pair

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件优化

取1 mg/L 4种糠醛类化合物的混合标准溶液上机检测，采用全扫描确定各化合物的质谱图，再经子离子扫描后，利用仪器配置的Trace Finder自动优化软件，确定两个子离子丰度较高时的碰撞电压，得到各待测物的2组母离子->子离子对，即目标化合物的定性和定量离子对，以响应值较高的离子对作为定量离子对，结果见表1。

基于化合物沸点及色谱柱使用范围优化色谱柱条件。由于目标化合物具有醛、醚和酮官能团，因此考察HP-5和RTX-WAX两种极性色谱柱对糠醛化合物的分离效果。结果显示，HP-5色谱柱存在严重的拖尾现象，分离效率差；而RTX-WAX极性色谱柱具有尖峰和高分辨率。因此，选择RTX-WAX色谱柱分离4种糠醛化合物。

图1 4种糠醛类化合物混合标准溶液的总离子流图

在优化条件下，F、FMC、MF、5-HMF得到了较好的分离，其混合标准溶液的总离子流图见图1。

2.2 前处理条件的优化

QuEChERS技术是本研究前处理的关键，为考虑多因素的综合效应，实验选择萃取试剂、盐析剂用量、净化剂用量3个因素设计实验，每个因素取2个水平，共8组实验，每组重复3次取平均值。实验的因素及水平条件选择如下：以乙腈或含有0.1%乙酸的乙腈为萃取剂；0.6 g NaCl+0.2 g NaAc或0.4 g NaCl+0.4 g NaAc为盐析剂；40 mg C18+10 mg PSA+100 mg MgSO4或30 mg C18+20 mg PSA+100 mg MgSO4为净化剂。结果显示，选择以乙腈为萃取剂，盐析剂为0.6 g NaCl+0.2 g NaAc，净化剂为40 mg C18+10 mg PSA+100 mg MgSO4时，4种糠醛类化合物回收率最优，达到90.6%～122%，满足实验要求。

2.3 方法学评价

2.3.1 标准曲线、线性范围与检出限配制4种糠醛类化合物的混合标准溶液，在优化条件下测定，以各化合物的峰面积(y)为纵坐标，对应质量浓度(x,mg/L)为横坐标，绘制标准曲线。结果显示，糠醛、2-呋喃基甲基酮、甲基糠醛、5-羟甲基糠醛在各自的质量浓度范围内线性良好，相关系数(r2)均不低于0.998。分别以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10计算方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得4种糠醛类化合物的LODs为1.0～15 μg/kg,LOQs为3.0～45 μg/kg(表2)。

表2 复原乳基质中4种糠醛化合物的线性范围、相关系数、回收率、检出限(LODs)及定量下限(LOQs)

2.3.2 回收率与相对标准偏差选择某品牌原味发酵乳，在优化条件下测定，得糠醛、2-呋喃基甲基酮、甲基糠醛、5-羟甲基糠醛的含量分别为0.038、0.022、0.010、0.093 mg/kg，再以其为基质进行低、中、高3个浓度水平的加标回收实验，每个水平平行实验6次，计算方法的加标回收率和相对标准偏差(RSD)。结果显示，4种糠醛化合物在3个加标水平下的平均回收率为82.2%～118%，RSD为0.74%～10%(表2)，表明该方法具有较好的准确度和精密度。

2.4 实际样品测定

采集市售相同生产日期的发酵乳(原味发酵乳5种，炭烧风味发酵乳6种)在优化条件下检测，发现4种糠醛化合物均有不同程度的检出，F、FMC、MF、5-HMF检出量分别为0.016～0.619、LOD～0.052、0.005～0.320、LOD～1.760 mg/kg，且5-HMF含量最高(表3)。其中样品2和样品6的色谱图见图2。

表3 11种发酵乳中4种糠醛类危害物含量

NF：not found

图2 实际样品色谱图

由表3可知，4种糠醛类危害物在炭烧风味发酵乳中的含量明显高于在原味发酵乳中，其中5-HMF含量高出近15倍。这可能是因为发酵乳生产工艺中涉及原料乳进行杀菌褐变(95 ℃,150 min)，经一些系列过程后再自然冷却发酵[21]，该处理过程中易产生相应的美拉德反应。炭烧风味发酵乳由鲜牛奶与糖经过长时间的高温加热后得到，其中的糖(羟基化合物)与氨基酸(氨基化合物)发生反应，产生具有特殊气味的棕褐色物质，美拉德反应进行更加彻底，导致糠醛类危害物含量明显增高，与实验结论相吻合。就本实验结果而言，热处理产生的糠醛类物质，对人体健康有一定影响;原味发酵乳中糠醛类物质含量更低，质量更优，从而可在两种发酵乳的选购上为消费者提供参考依据。同时，炭烧风味发酵乳发酵工艺复杂，成本高，建议乳制品工业在满足风味要求的基础上，尽量减少热处理，保证发酵乳品质。

3 结 论

本文利用气相色谱-三重四极杆串联质谱法结合QuEChERS技术，对发酵乳中4种糠醛类化合物进行了定性定量分析。该方法前处理操作简单快速，加标回收率和相对标准偏差均满足要求，具有灵敏度高，检出限低，准确度好，重现性好等优点。通过对原味发酵乳和炭烧风味发酵乳中的糠醛类物质含量的比较可间接评价其质量优劣。结合发酵乳生产工艺，探究了炭烧工艺技术对糠醛产生量的影响，进而对消费者合理选择发酵乳提供建议与指导，同时建议乳制品工业生产尽量减少不必要的热处理，保证发酵乳品质。