miR-92a表达与结直肠癌病理学特征及MVD形成的关系

张志勇 丁惠娟 王伟民

结直肠癌(CRC)是病死率较高的消化系统肿瘤，在发病早期无明显症状，不易被诊断，因此加强早期诊断有利于增加结直肠癌患者的存活时间，及时实施治疗手段[1]。microRNAs(miRNAs)是一系列非编码微小RNA，其高表达和原癌基因作用相似，引起细胞复制与分化功能过度激活，从而诱发肿瘤的难逆性发展[2]。有研究显示[3]，miR-92a在多种肿瘤组织中表达异常，尤适用于结直肠癌患者，且对比其他的血清分子标志物具有高灵敏度、特异性等优势。因此，miR-92可能属于癌基因，在CRC的发展进程中拥有推动作用。同时，难控性血管再生是恶性肿瘤的重要辨别特征，血管再生常促进肿瘤细胞的浸润、转移[4]。李利发等[5]研究发现，miR-92a可能介导血管内皮细胞的产生，加速肿瘤的恶化速度。但目前对于miR-92a表达与CRC病理学特征和MVD形成的确切及时未有统一结果。本研究通过对不同病理学分期CRC患者的病理学特征与MVD数量，探究miR-92a临床应用的实际意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取2016年1月至2017年10月我院收集的结直肠癌组织80例(癌组织)、80例癌旁组织。男性44例，女性36例，年龄35～75岁，平均(54.1±11.6)岁，TNM分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期29例、Ⅲ期27例、Ⅳ期4例；发生淋巴结转移45例；分化程度：高分化20例、中分化34例、低分化26例；浸润深度：T1～T2 27例、T3～T4 53例。纳入标准：①结直肠癌患者的诊断标准参考人民卫生出版社《外科学》第八版；②经手术后病理学检查确诊,病理学诊断均为腺癌；③术前患者无放化疗史；④患者知情并签署知情同意书，获得医学伦理委员会的批准。排除标准：①转移性结直肠癌；②凝血功能疾病；③其他部位恶性肿瘤病史。

1.2 qRT-PCR技术

首先根据Trizol法对患者结直肠癌组织实施总RNA的抽提，进而对其浓度和纯度进行检测。得到稀释后的RNA样品。依据RNA逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应。每个样本取1 μg 总RNA 进行反应，反应条件为42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min。内参基因反应条件同上。取1 μl cDNA进行PCR扩增，反应条件为95 ℃ 5 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火45 s，40个循环。miR-92a含量计算利用绝对定量方法，计算miR-92a的浓度，U6 snRNA内参qRT-PCR的反应条件如上。

1.3 免疫组化染色

对结直肠癌组织标本进行脱水、石蜡包埋，制成4 μm切片。用柠檬酸盐缓冲液实施高压热修复，一抗为鼠抗人CD31单抗(1∶100)，用PBS作为阴性对照，用阳性片作为阳性对照，按照ABC法检测内皮细胞CD31表达。血管新生情况以微血管密度(MVD)表示，以CD31阳性表达的棕黄色血管内皮细胞表示1条单独的微血管，先在低倍镜(×100)下选择血管高密度区，再于高倍镜(×400)下随机选取5个视野，计算其微血管数目平均值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组标本组织中的miR-92aRNA表达比较

癌组织中的miR-92aRNA表达强度显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 两组标本组织中的miR-92aRNA表达比较

2.2 两组标本组织中CD31表达比较

癌组织中的CD31检出率显著高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 两组标本组织中的CD31表达比较

2.3 两组标本组织中的miR-92aRNA表达与CD31表达的相关性

癌组织中的miR-92aRNA表达与CD31检出率呈显著正相关关系(γ=0.593，P<0.05)。

2.4 结直肠癌组织的miR-92aRNA表达与临床病理学特征的关系

结直肠癌癌组织中的miR-92aRNA表达强度在不同TNM分期、是否发生淋巴结转移、不同浸润深度的组织中表达强度具有显著的差异(P<0.05)；结直肠癌组织中的miR-92aRNA表达强度在不同分化程度的癌组织中表达差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

3 讨论

Michael等首先观察到miR-143在CRC患者的肿瘤组织中的表达明显降低，提出microRNA可能在CRC患者早期疾病诊断上具有一定作用[6]。从这以后，利用 microRNA来诊治CRC的案例逐渐变得普遍，其关于作用途径的研究也有所突破。依据对CRC的作用效果不同通常分为致癌microRNA和抑癌microRNA，现临床资料显示[7]在CRC中前者的表达更为普遍。miR-92a属于miR-17-92基因簇家族，其已被证实[8]为致癌microRNA，主要机制是通过阻止癌基因PTEN介导的PI3K/AKT通路，进而诱导CRC细胞增殖、分化，使肿瘤生长的速度增加，进一步恶化病情。也有研究显示[9]，其对肿瘤细胞的作用是通过下调凋亡蛋白(Bim)的表达水平。王秀等[10]研究表明，miR-92a在腺瘤和CRC患者中表达水平与miR-17-92簇其他基因比较明显上升，同时，CRC细胞中加入miR-92a拮抗剂将抑制细胞生长，说明miR-92a能够用作诊治CRCd的重要方式。同时CRC疾病的过程中也伴有血管新生的情况，血管新生也是肿瘤组织生长的特征现象[11]。肿瘤细胞内血管内皮细胞若受到一系列的化学刺激，将促进肿瘤微血管密度增加，促进肿瘤细胞的生长。李鹏等[12]研究表明，miRNA能特异性与血管生成因子和蛋白激酶发生反应，调控血管生成所需的因子，进而控制肿瘤的血管新生。通过血清microRNA诊断CRC，具有操作简单、灵敏度高、特异性强等优势[13]，但现如今利用血清miR-92a探究其与疾病恶化程度和MVD形成的研究并不多见，因此，本研究对以上两种指标与miR-92a基因表达的相关性进行探讨，具有一定科学性依据。

表3 结直肠癌组织的miR-92aRNA表达与临床病理学特征的关系

本研究中qRT-PCR结果显示，癌组织中miR-92aRNA表达水平明显高于癌旁组织，得出miR-92aRNA可能具有致癌作用，其高表达能够作为诊断TNM分期的各期CRC的手段。可能与miR-92aRNA阻止癌基因PTEN介导的PI3K/AKT通路，诱发肿瘤细胞持续恶化有关[14]。因CD31阳性表达的棕黄色血管内皮细胞，可看作为一条MVD。本研究通过免疫组化得出，癌组织的CD31检出率较癌旁组织明显增加，即说明前者MVD的形成更多，相应的提示前者细胞癌变情况严重。同时本研究发现，癌组织中的miR-92aRNA表达强度与CD31检出率表现为正相关性。说明miR-92aRNA的高表达能够促进MVD的形成，相反其低表达则表示MVD的形成受到抑制。 可能原因是Ⅲ期～Ⅳ期结直肠癌细胞可合成释放出内含miR-92a的微泡(MVs)，其被传送至血管内皮细胞，使下游靶基因Dkk-3表达增强，促进内皮细胞复制、迁移，让内环境可为肿瘤血管生成提高能量，推动肿瘤进程[15]。本研究通过分析miR-92aRNA表达与临床病理学特征得出，miR-92aRNA表达在不同TNM分期、是否发生淋巴结转移、不同浸润深度的组织中各不相同，而在不同分化水平细胞中无明显区别，提示miR-92aRNA的表达程度对Ⅲ～Ⅳ期CRC的恶化程度检测敏感，而对于Ⅰ～Ⅱ期CRC敏感度相对较低，另外对于分化水平分类的CRC诊断效果差，这与王亚南等[16]研究结果类似。

根据以上分析可看出，Ⅲ～Ⅳ期CRC组织中的miR-92aRNA表达明显上调，并且与肿瘤恶化和MVD形成有关。因此，miR-92aRNA可作为临床早期诊断Ⅲ～Ⅳ期CRC的方式，也能够作为治疗的药物作用靶点。但本研究尚未考虑microRNA能够调控多种基因表达，对其靶向治疗存在一定阻碍，另外有研究显示[17]，表达miR-320a也可以抑制结肠癌细胞增殖、侵袭，可作为新的治疗方向。本研究样本量少，后续仍需进行大量临床数据收集，为深入探究miR-92aRNA在临床应用的实际意义。