食管鳞癌中STC2、MMP-9及PCNA表达情况

童 薇 张 敬 朱艳丽 雍 翔

食管癌属于1种消化道恶性肿瘤，在临床极为常见。在我国，食管癌具有较高的发病率及死亡率[1]。近年来，相关医学研究表明[2]，在恶性肿瘤中，食管癌发病率位居第五位，死亡率位居第四位，仅次于肺癌、肝癌、胃癌。要想有效治疗食管癌，对患者预后进行改善，就应该将能够将食管癌发生发展及预后特征性反映出来的分子生物学指标寻找出来。本研究探讨了食管鳞癌中STC2、MMP-9及PCNA表达情况。

1 材料与方法

1.1 一般资料

随机选取2016年4月至2019年4月我院食管鳞癌患者80例，其中男性50例，女性30例，年龄46～80岁，平均(63±5.0)岁。另选取癌旁1～3 cm处组织40例，对应癌瘤灶旁5 cm以外处上下残端正常食管粘膜组织40例。

1.2 实验材料

购买Proteintech公司生产的STC2抗体稀释1∶50，北京中杉金桥公司生产的MMP-9、PCNA一抗稀释1∶100，二氨基联苯胺(DAB)试剂盒、PV-6001、6002免疫组化试剂盒，PBS磷酸盐缓冲液，日本奥林巴斯BX41显微镜，德国2035石蜡切片机。

1.3 方法

应用免疫组织化学二步法，用切片机连续切片组织蜡块，切片厚度为4 μm左右。然后漂片，之后摊片，最后烤片。在二甲苯Ⅰ中放置切片10 min，在二甲苯Ⅱ中放置切片10 min，在无水酒精Ⅰ中放置切片3 min，在无水酒精Ⅱ中放置切片3 min，在90%酒精中放置切片3 min，在80%酒精中放置切片3 min，在70%酒精中放置切片3 min，脱蜡至水。在3%过氧化氢去离子水中进行15 min的孵育，将内源性过氧化物酶阻断，PBS冲洗。在高压锅中放置，对抗原进行高压修复，压力阀喷气后计时2 min，然后自然冷却到室温，PBS浸洗。将兔抗人STC2抗体、MMP-9抗体、鼠抗人PCNA抗体滴加到三组切片中，在室温下进行1～1.5 h的孵育，然后在4 ℃的温度下过夜。第2 d用PBS进行5 min浸洗，共3次。将PV-6001滴加到STC2、MMP-9中，将PV-6002滴加到PCNA中，在37 ℃的温度下进行1 h的孵育，PBS进行5 min浸洗，共3次。将DNA滴加其中进行2～3 min显色，冲洗过程中将蒸馏水充分利用起来，将染色终止。苏木精复染3 min，过水。盐酸酒精一过、氨水3 min，过水。80%酒精5 min，90%酒精5 min，无水酒精Ⅰ5min，无水酒精Ⅱ5 min，透明，封片过程中将中性树胶充分利用起来。将说明书推荐组织切片设定为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 观察指标

显微镜下对肿瘤细胞阳性率进行评定，将5个区域随机选取出来，×400倍光镜下对肿瘤组织中的阳性细胞数进行计数，最终将平均值计算出来。STC2阳性染色颗粒在细胞质中分布，呈棕黄色，阳性肿瘤细胞率0～10%、11%～50%、51%～75%、76%～100%分别评定为0、1、2、3。肿瘤细胞无着色、淡黄色、黄色、棕黄色分别评定为0、1、2、3。染色阳性细胞率×染色强度=染色指数，<4、≥4分别评定为阴性、阳性[3]。MMP-9阳性信号为抗体有棕黄色颗粒出现在细胞质中，将5个高倍视野(×400)从每张切片中随机选取出来观察，阳性细胞数<10%、≥10%分别评定为阴性表达、阳性表达[4]。PCNA阳性染色颗粒在细胞核中分布，呈棕黄色，将各例标本阳性细胞百分率计算出来，分为四级，0～25%、25%～50%、51%～75%、76%～100%分别评定为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级。无阳性反应、Ⅰ～Ⅳ级分别评定为阴性、阳性[5]。

1.5 统计学分析

计数资料用率表示，应用χ2检验。用COX回归分析进行多因素分析，应用SPSS 21.0软件分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 不同组织中STC2、MMP-9及PCNA表达情况比较

食管鳞癌组织中STC2、MMP-9及PCNA表达阳性率均显著高于食管癌旁、正常食管粘膜组织(P<0.05)，食管癌旁组织中STC2、MMP-9表达阳性率均显著高于正常食管粘膜组织(P<0.05)，但食管癌旁、正常食管粘膜组织中PCNA表达阳性率的差异不显著(P>0.05)，见表1。

表1 不同组织中STC2、MMP-9及PCNA表达情况比较(例，%)

2.2 食管鳞癌患者STC2、MMP-9及PCNA表达与临床病理参数的相关性分析

食管鳞癌患者病理分期Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级低分化、有淋巴管浸润、淋巴结转移患者的STC2、MMP-9及PCNA表达阳性率显著高于病理分期Ⅰ～Ⅱ期、病组织学分级中高分化、无淋巴管浸润、淋巴结转移患者(P<0.05)，但不同性别、年龄、病变长度、病变直径、肿瘤部位患者的STC2表达阳性率之间的差异均不显著(P>0.05)。具体见表2。

3 讨论

斯钙素2(STC 2)属于1种糖蛋白激素，在肾脏、肠的钙磷运输、细胞内钙磷平衡中参与。近年来，相关医学研究表明[6]，乳腺癌、胃癌、喉癌等多种肿瘤组织中具有较高的STC 2表达，同时，肿瘤生长、侵袭等均和STC 2关系密切。相关医学研究表明[7-9]，STC 2在肿瘤发生发展过程中和肿瘤组织适应低氧环境相关，同时在肿瘤细胞增殖中参与，通过血管生成素(Ang-2)、血管内皮生长因子(VEGF)为肿瘤组织血管生成提供良好的前提条件，促进肿瘤侵袭性的增加，为淋巴细胞转移提供良好的前提条件。相关医学学者研究了食管癌中的STC 2[10-11]，结果表明，肿瘤增殖、侵袭、淋巴结转移、远处转移均和STC 2关系密切，同时，食管癌预后也和STC 2关系密切。基质金属蛋白酶9(MMP-9)属于1种Ⅳ型胶原酶，能够对细胞外基质的合成、降解代谢进行调节，进而对细胞和细胞间、细胞和基质间的信号传递造成影响，从而对细胞分化、迁移、组织重塑等进行调节，为肿瘤细胞侵袭、转移提供良好的前提条件。MMP-9能够表达于肿瘤细胞、成纤维细胞等多种细胞中。增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶的辅助蛋白，在细胞核中有两种PCNA存在，1种具有可溶性，另1种具有不溶性，其中可溶性PCNA表达于细胞周期各期中，在DNA合成过程中，其表达量变化不显著；不溶性PCNA具有较高的稳定性，不显著表达于G0～G1期细胞中，大幅度表达于G1晚期细胞中，达到高峰在S期细胞中，显著降低在G2-M期细胞中，DNA合成和其表达量一致，对其在细胞中的表达进行检测能够将有效依据提供给临床对细胞增殖状态的评定工作。

表2 食管鳞癌患者STC2、MMP-9及PCNA表达与临床病理参数的相关性分析(例，%)

肿瘤侵袭、转移和STC2、MMP-9关系密切，肿瘤细胞增殖和PCNA关系密切。但是现阶段，还较少有相关医学研究报道上述3个指标联合检测在食管癌组织中的意义。相关医学研究表明[12-15]，和癌旁组织、正常食管粘膜组织相比，食管癌组织中具有显著较高的STC2、MMP-9及PCNA表达，病理分期、低分化、淋巴管浸润、淋巴结转移均和其关系密切。在食管癌患者预后的影响因素中，STC2是独立因素，如果患者具有较高的STC2、MMP-9及PCNA表达，那么其就会具有较差的生存预后，而如果患者同时具有较高的STC2、MMP-9及PCNA表达，那么其就会具有更差的生存预后。本研究结果表明，食管鳞癌组织中STC2、MMP-9及PCNA表达阳性率均显著高于食管癌旁、正常食管粘膜组织，食管癌旁组织中STC2、MMP-9表达阳性率均显著高于正常食管粘膜组织，但食管癌旁、正常食管粘膜组织中PCNA表达阳性率之间的差异不显著。食管鳞癌患者病理分期Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级低分化、有淋巴管浸润、淋巴结转移患者的STC2、MMP-9及PCNA表达阳性率显著高于病理分期Ⅰ～Ⅱ期、病组织学分级中高分化、无淋巴管浸润、淋巴结转移患者，但不同性别、年龄、病变长度、病变直径、肿瘤部位患者的STC2表达阳性率之间的差异均不显著，和上述相关医学研究结果一致。

总之，食管鳞癌中STC2、MMP-9及PCNA表达阳性率均显著提升，与病理分期、组织学分级、淋巴管浸润、淋巴结转移密切相关，值得重视。