野生五叶草莓的组织培养繁殖技术研究

王军利，千小绵，吴紫安，羊 波，李 伟，王 新

(1.咸阳职业技术学院，陕西 西咸新区 712046；2.陕西省农业宣传信息中心，陕西 西安 710003；3.紫阳县蒿坪镇农业综合服务站，陕西 紫阳 725300；4.汉中市汉台区农产品质量安全监测检验中心，陕西 汉中 723000；5.安康市汉滨区石梯镇农综站，陕西 安康 725000)

蔷薇科草莓属的植物在全世界约有50种，其中全球广为栽培的草莓，是由八倍体凤梨草莓(Fragariaananassa)培育而成的栽培种，其他倍性的草莓则多呈野生或半野生状态分布于全球各地[1～2]。常见的野生草莓约有20种，中国自然分布约11种，秦巴山地为中国野生草莓的主要集生地之一，大约有7种，分别是二倍体(2x)的森林草莓(F.vescaL.)、黄毛草莓(F.nilgrrensisSchlecht.)、五叶草莓(F.pentaphyllaLonzink.)和纤细草莓(F.mubicolaLindl.)，以及四倍体(4x)的东方草莓(F.orientalisLozinsk.)、伞房草莓(F.corymbosaLozinsk.)和西南草莓(F.moupinensis(Franch)Card.)[2～6]。为了开发、利用野生草莓资源，我国各地大量的科研人员进行很多努力，对我国野生草莓资源的分布进行调查和鉴定[1～5]、对野生草莓进行引种驯化[6]、利用野生资源进行常规育种[7～8]、用组织培养的方法对部分野生草莓进行培养与快繁[9、10]等，但对于秦巴山地野生草莓资源的组培研究，所见资料甚少。为了开发利用秦巴山地的野生草莓资源，笔者在前人工作的基础上，研究了秦巴山地野生五叶草莓的组织培养快繁技术，为五叶草莓的离体再生提供了实验技术，为其离体染色体加倍提供了前期的实验材料，也为秦巴山地其他野生草莓的组培快繁提供了参考路径。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的五叶草莓源自陕西省秦巴山区。项目组将其采挖回来后，栽培在咸阳职业技术学院仪祉农林学院实训基地的专门苗圃。野生五叶草莓植株长势强，匍匐茎和叶柄被直立绒毛，花序梗和小花梗亦密被直立绒毛，小叶5，极稀3，叶片质地较厚，正面无毛，背面被疏绒毛，宿萼反折，果实白色，圆形或椭圆形，种子多枚，陷于果面下。根据这些特征，项目组运用《中国植物志》[11]《秦岭植物志》[12]《中国果树分类学》[13]及其他相关检索、鉴定资料(雷家军，2004)[14]，对其进行了鉴定。

1.2 方法

1.2.1 五叶草莓无菌苗的获得 在秦巴山地草莓属野生植物资源苗圃地，选无病虫害的五叶草莓健壮苗，用剪刀剪取2 cm左右的匍匐茎顶端，放置在大烧杯中，置于水龙头下流水冲洗4～6 h，再在超净工作台上用无菌镊子将其夹出，放入盛有75%酒精的烧杯中消毒35 s，然后再用2%的NaClO消毒10～15 min，用无菌水冲洗4～6次，再用无菌滤纸吸干表面的水分，在垫有无菌滤纸的培养皿中用灭菌后放凉的解剖刀切取长约0.5～1.0 cm的茎尖(带有一个叶原基)作为外植体，接种在Ph=5.8～6.0的MS+0.5 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂粉的固体培养基上，每个培养瓶接种3个外植体。接种后，将培养瓶放置在培养室中培养，期间注意观察污染情况，及时将未被污染的外植体转接到新的培养基上。培养条件：光照时长为15 h/d，光强为1 500～2 000 Lux，温度为25(±2)℃。消毒过程中，由于五叶草莓通体被有绒毛，为使消毒彻底，每一步都不断振摇或搅拌。

1.2.2 不同浓度的6-BA对五叶草莓离体增殖的影响 基本培养基为MS培养基，添加蔗糖30 g·L-1，琼脂粉7 g·L-1，pH5.8～6.0，NAA浓度为0.1 mg·L-1。6-BA设置4个浓度处理：0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.6 mg·L-1。选取生长均匀，高度3～5 cm，具有4片叶子的五叶草莓无根试管苗接种到该培养基上。每个培养瓶接种4个无根试管苗，每个处理接种15瓶。接种30 d后，统计外植体增殖倍数。

1.2.3 基本培养基和生长素种类对五叶草莓生根的影响 基本培养基和生长素的选择设4种配比方式：MS+0.2 mg·L-1IBA、MS+0.2 mg·L-1NAA、1/2 MS+0.2 mg·L-1IBA以及1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA。无根草莓试管苗的选取：选取在MS+0.4 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培养基上生长健壮的无根草莓苗，高度5 cm左右，具有5片叶子。每种培养基接种10瓶，每瓶接种3株无根试管苗。接种30 d后，观察根系生长情况，并统计生根数。

2 结果与分析

2.1 五叶草莓无菌苗的获得

五叶草莓无菌苗的获得过程中，接种3 d后开始褐化，褐化比率近乎90%，最终褐化致死率达67.1%。褐化程度不严重、未致死的消毒茎尖，在接种21 d时，不经愈伤组织阶段开始萌发新芽，并最终形成丛生芽，获得五叶草莓无菌苗。

2.2 不同浓度的6-BA对五叶草莓离体增殖的影响

将由茎尖培养后选取的相同规格的五叶草莓无菌苗，接种在6-BA不同浓度处理的5种增殖培养基上，30 d后观察增殖苗生长情况，并统计增殖数量，计算出增殖倍数。结果见表1。

由表1可见，当6-BA的浓度为0.2 mg·L-1时，五叶草莓长势健壮，但增殖倍数较低；当6-BA的浓度增加到0.3 mg·L-1时，增殖倍数增加，增殖苗生长健壮，叶色浓绿；当6-BA的浓度增加到0.4 mg·L-1时，增殖倍数继续增加，外殖体增殖苗长势良好。但当6-BA浓度增加到0.5 mg·L-1时，增殖倍数越过峰值开始下降，且增殖苗长势变弱，偶有黄化现象；而6-BA浓度增加到0.6mg·L-1时，增殖倍数下降幅度很大，大多未见增殖，苗低矮、畸形，黄化程度比较严重。由此可见，当基本培养基为MS，NAA浓度为0.1 mg·L-1时，五叶草莓离体增殖的最佳6-BA添加浓度为0.4 mg·L-1。

2.3 基本培养基和生长素种类对五叶草莓生根的影响

选取生长健壮的同规格的五叶草莓无根试管苗接种在4种不同的生根培养基上，30 d后，观察其诱导生根情况，结果见表2。

表1 不同浓度6-BA对五叶草莓无菌苗增殖的影响

表2 基本培养基及生长素对五叶草莓生根的影响

在实验过程进行时可以观察到，无论哪种生长调节剂，1/2 MS培养基上的无根试管苗生根都早于MS培养基。由表2可见：当生长调节物为IBA时，无论1/2 MS培养基还是MS培养基，接种30 d后，五叶草莓的无根试管苗的生根率都达到100%，高于NAA的诱导率，但NAA为添加的生长调节剂时，诱导生成的根普遍粗壮，长度也普遍大于以IBA为诱导调节剂。株平均诱导根数以1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA培养基为最大，每株达6.9根，且长度超过1.0 cm的根在总根数中占比超过41.1%。虽然IBA作为生根调节剂的生根率更高，但NAA作为添加的生根调节剂时，诱导的根更粗壮、更长、单株生根数更多，植株在练苗后更容易成活而长成健壮幼苗；另外，随着诱导时间的延长，超过37 d时，NAA为调节剂的诱导生根率也达到100%。故此，诱导五叶草莓无根试管苗生根的合适培养基为1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA。

3 讨论与结论

秦巴山区有丰富的野生草莓资源。较之于栽培草莓，野生草莓在抗病虫害、抗逆性、可溶性有机物含量、果实颜色丰富度以及果实香味物质种类等方面，有较大的优势[1～6]。为了利用这些自然资源，有必要对其进行搜集、整理、研究。野生五叶草莓长势强，生命力旺盛，叶片厚，浓绿，果实颜色为栽培草莓中少见的白色，果肉细腻绵软，香味浓郁，是优质的杂交育种资源，也是通过倍性增加、细胞融合甚至转基因方法进行育种的优质基因源[1～6、14]，对其进行组织培养研究，建立茎尖培养组培快繁技术，为其离体再生、染色体加倍及细胞融合等工作奠定了基础，对于其野生资源的开发、利用，具有重要意义。

在外殖体的获得时，发现剥取的茎尖越小，褐化死亡率越高；越大，越有利于外植体成活，这与王会[10]对红石美草莓及王燕[9]对黄毛草莓的研究结论一致，可见在草莓组织培养外殖体的切取过程中，组织越幼嫩、切口相对越大，外植体越容易褐化。在6-BA对五叶草莓离体增殖的研究中，发现在一定范围内，随着6-BA浓度在培养基中含量的增加，草莓离体增殖倍数增大，但超过一定的峰值后，反而下降，这与王燕[9]对黄毛草莓的研究结论一致。在基本培养基和生长素对五叶草莓生根的影响实验中，IBA作为生长调节物时，30 d试管苗生根率达100%，无论哪种生长调节剂，1/2 MS培养基上的无根试管苗生根都早于MS培养基，这些都和王燕[9]对黄毛草莓的研究结论一致，但在NAA作为调节物生成的根粗壮、结实，这与王燕[9]对黄毛草莓的研究结论不一致。可见，同为草莓属植物，在实验条件基本一致时，不同的种，实验结论会有不同。所以不同植物材料进行组织培养时，具体植物的合适培养基和添加剂，要通过实验取得。

实验中得到以下结论：利用野生五叶草莓匍匐茎茎尖在MS+0.5 mg·L-16-BA培养基上获得无菌苗，适合五叶草莓快繁的培养基为MS+0.4 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，增值倍数为8.150；适合其诱导生根的培养基为1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA，单株诱导根数最大，诱导根粗，长度长，有利于形成壮苗。