商洛南五味子甲素提取及复配防腐保鲜液研究

张晓虎，雷郁佳，张子璇，吕 晨，郭元园

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

引言

木兰科植物南五味子(SchisandrasphenantheraRehid.et Wils.)的干燥成熟果实，富含蛋白质、脂肪、糖类、有机酸、果胶等食用物质，且含有五味子甲素、乙素、丙素、五味子醇甲、醇乙、五味子酯甲等活性成分，除具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心等药用功效外，还具有保肝护肝、免疫促进、抗衰老、抗肿瘤等保健作用，被誉为“药食同源”植物[1～4]。

五味子果实因含天然抑菌活性成分而得以长期存放，如木脂素类的主要成分之一的五味子甲素，具有明显的抗炎、抗病毒作用，能抑制多种病原菌及致病菌，因此南五味子中有效活性成分具有开发为天然食品防腐剂资源的潜力[5～7]。闫绍悦等[8]提取了五味子中的活性成分木脂素，将其用于三种常见标准菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌)的抑菌试验表明，五味子甲素提取物对被测菌有明显的抑制作用。张媛媛等[9]研究了五味子中粗提物抗菌成分对毛霉和金黄色葡萄球菌的影响，并在面制食品的贮藏保鲜中取得了较好效果。

研究选取秦岭腹地陕西省商洛市知名“五大商药”之一的南五味子为对象，采用响应面法优化南五味子甲素提取工艺，以AB-8型大孔树脂对南五味子甲素分离纯化并进行抑菌实验，将南五味子甲素与壳聚糖、柠檬酸、氯化钙复配制备防腐保鲜液，并以烂果率、pH值、失重率、硬度等为指标检测对后熟香蕉保藏试验效果，以期为南五味子甲素应用于果蔬类食品的防腐保鲜提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 主要有:

(1)材料：南五味子果实(2018年9月采摘于商洛市山阳县高坝镇南五味子种植基地)；市售黄熟香蕉(购自商洛市华润万家超市)。

(2)试剂：五味子甲素标品(购自上海金穗生物科技有限公司)；无水乙醇，95%乙醇，甲醇，以上均为分析纯；蒸馏水，脱乙酰度≥90的壳聚糖，食品级柠檬酸，氯化钙，胰蛋白胨，葡萄糖，琼脂，生理盐水，AB-8型大孔吸附树脂。

(3)菌种：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌(购自西安市长安区瑞昇化玻仪器供应站)。

1.1.2 主要仪器 SI-234型电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司；JP-500C型高速多功能粉碎机，永康市久品工贸有限公司；N-1100型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；pHS-25型数显pH测试仪，上海始恒仪器有限公司；GY-3型果实硬度计，上海精密仪器仪表有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津有限公司。

色谱条件：色谱柱，ODS-3(C18)(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(75∶25)；流速：1 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：25℃；进样量：1.0 μL。

1.2 研究方法

1.2.1 材料预处理 南五味子果实先经清洗、50℃杀青、风干后，恒温(60℃)干燥2 h；再经粉碎、过筛(40目)，最后置于干燥的广口瓶中备用。

1.2.2 五味子甲素标准曲线的制备 五味子甲素标准品溶液：将精密称取4 mg的五味子甲素标品溶解在装有甲醇的10 mL容量瓶中，定容，摇匀，制备成浓度为400 μg·mL-1的五味子甲素标准品溶液。

五味子甲素标准曲线：分别将上述制备的标品溶液精确吸取0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL加到10 mL的5个容量瓶中，用甲醇稀释并标定，根据1.1.2色谱柱条件重复进样并测定峰面积。以五味子甲素的相应峰面积为纵坐标、浓度为横坐标，绘制五味子甲素标准曲线[10,11]见(图1)，得出线性回归方程：y=0.1699x-0.5046，R2=0.9986。

1.2.3 五味子甲素的提取 在100 mL烧杯中加入一定浓度和比例的乙醇，将准确称取的5.0 g南五味子粉末浸泡在其中5 min，充分混合并搅拌均匀，然后置于水浴温度75℃的条件下重复提取三次，抽滤，合并滤液并旋蒸，回收乙醇，再次抽滤，称量记录体积。

1.2.4 五味子甲素得率的测定 吸取五味子甲素浓缩提取液1.0 mL于25 mL容量瓶中用甲醇定容，同1.1.2色谱柱条件重复进样三次，将测得的峰面积求出平均值，结合回归方程按式(1)计算粗提取液中南五味子甲素的得率[12]。

(1)

式中：C—五味子甲素浓度(μg·mL-1)；N—溶液的稀释因子；V—稀释剂体积(mL)；—提取物样品体积(mL)；W—五味子甲素质量(g)。

1.2.5 单因素试验 按1.2.3五味子甲素提取方法，分别考察液料比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14)，提取温度(50、60、70、80、90℃)，乙醇体积分数(40、50、60、70、80 %)，提取时间(0.5、1、1.5、2、2.5 h)对商洛南五味子甲素提取率的影响。

1.2.6 响应面试验设计 依据响应面设计试验原理，设计3因素、3水平响应面分析实验，经Design-Expert 8.0.6软件分析得出试验数据，优化提取工艺参数。

1.2.7 验证性试验 依照响应面优化得到的最佳提取工艺条件，对南五味子甲素的得率测定进行三次平行试验，与预测值相比较，评价模型与实际实验拟合程度。

1.2.8 五味子甲素的初步分离纯化 大孔吸附树脂的前处理：将AB-8型树脂在95%的乙醇中浸泡24 h，待完全膨胀后，把较碎的和细小的树脂剔除，将剩余的大孔树脂装入一个干净的大烧杯中，用95%乙醇反复冲洗，直到洗涤液与水以1∶5混合却还澄清时，再继续用去离子水冲洗到没有醇味，冲洗完成后将其浸泡在去离子水中备用[13]。

吸附量与解吸量的计算：在250 mL具塞磨口三角瓶中装入2.0 g预处理过的树脂，精确添加100 mL浓度已知的南五味子甲素提取液，使树脂与提取物完全混合。摇动装树脂的三角瓶2 h，每10 min摇动一次，每次30 s。放置24 h直至饱和吸附，过滤，测定滤液中南五味子甲素的浓度[14]。大孔树脂对南五味子甲素的吸附量与吸附率按式(2)与式(3)计算。

Qe1=(C0-C1)V0/M

(2)

(3)

式中：Qe1—吸附量(μg·g-1)；C0—南五味子甲素在粗提液中的质量浓度(μg·mL-1)；V0—粗提液的体积(mL)；C1—南五味子甲素在吸附液中质量浓度(μg·mL-1)；M—湿树脂的质量(μg·g-1)；Q1—吸附率。

饱和吸附后，用去离子水清洗树脂，再加入已知浓度的乙醇溶液100 mL，振摇2 h，每15 min振摇1次，每次30 s，放置24 h至解吸完全，取解吸液，测定南五味子甲素质量浓度[15]。大孔树脂的解吸量与解吸率按式(4)与式(5)计算。

Qe2=C2V1/M

(4)

(5)

式中：Qe2—解吸量(μg·g-1)；C2—解吸后南五味子甲素浓度(μg·mL-1)；V1—解吸液体积(mL)；Q2—解吸率。

1.2.9 抑菌试验 菌悬液的制备：选择活化菌接入装有适量无菌水的试管，将混悬液震荡摇匀，制备成浓度为1×105cfu·mL-1的菌悬液备用。

南五味子甲素抑菌能力的测定：先将待测菌的悬浮液分别取0.1 mL加入已制备好平板培养皿中，涂抹均匀。所提取的南五味子甲素被配制成100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、0 mg·mL-16个不同浓度梯度后，将121℃干热灭菌2.5 h的直径为6 mm的滤纸小圆片完浸泡在以上制备的不同浓度南五味子甲素溶液中，浸渍完全后取出并干燥。把经过以上处理的滤纸片放入含有待测菌的培养皿的表面中心，之后在37℃的恒温环境中培养24 h，用十字交叉划线法测定抑菌区的直径[16～18]。

1.2.10 香蕉保藏试验 按表1的配方制备不同处理的保鲜防腐液。

表1 不同防腐保鲜液的配方 (%)

将完整无损、大小均匀、果形端正且饱满的黄熟香蕉选为供试材料，用无菌水清洗除去污垢后，分为若干组(每组7根)，然后放置在室内自然晾干；将配制的防腐保鲜涂膜液均匀涂布在处理好的香蕉上并晾干，放到无菌托盘上用聚乙烯薄膜保鲜膜密封，每个组合重复3组，在固定温湿度(25℃、65%)的恒温培养箱贮藏7 d，测定观察有关指标，选择最佳复配组合[19,20]。

烂果率：以果实表皮腐烂面积与总面积比例P为依据，将腐烂程度分为4个等级。P=0，0级；030%，3级[21]。按式(6)(n=3)计算烂果率。

(6)

式中：Nt—时间为t时的腐烂级别；Rt—时间为t时各腐烂级别相应的果实数，个；Rmax—腐烂最高级别；N0—试验香蕉果实总数，个。

失重率：按式(7)计算香蕉果实失重率。

(7)

式中：m0—初始质量，g；m1—贮藏一段时间后的质量，g。

果实硬度：用果实硬度计重复测量香蕉果实不同三个部位的硬度，取平均值。

pH值：剥离香蕉皮后，准确称取10 g，切碎放入装有100 mL蒸馏水的烧杯中浸泡15 min，振摇3～4次，过滤得到浸出液，用pH分析仪浸入待检浸出液中，数秒后取出，读取pH值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比对南五味子甲素得率的影响 由图2可知，随着料液比的增加，南五味子甲素提取量逐渐增大，当时间达到1∶10时，提取量已达到最大。继续增加料液比，提取量无明显改变。因此，考虑到节约且高效的原则，选取最佳料液比为1∶10。

2.1.2 提取温度对南五味子甲素得率的影响 由图3可知，提取温度对南五味子甲素提取量的影响呈先升后降的趋势，温度在50～80℃时，提取量随提取温度升高而增加，当提取温度超过80℃时，提取量明显下降。因此，选择80℃为较佳的提取温度。

2.1.3 乙醇体积分数对南五味子甲素得率的影响 由图4可知，乙醇体积分数对南五味子甲素提取量的影响呈先升后降的趋势。乙醇体积分数为80%时提取量最高。因此，选取80%作为较佳的乙醇浓度。

2.1.4 提取时间对南五味子甲素得率的影响 由图5可知，随着提取时间的增长，南五味子甲素的提取量呈增加趋势，当提取时间超过2 h后，提取量则明显减少。因此，选择2 h为较佳的提取时间。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验方案与结果 基于单因素试验，在固定料液比为1∶10的前提下，选择乙醇体积分数、提取温度和提取时间这三个对商洛南五味子中五味子甲素得率影响较大的因素设计响应面试验，响应面试验方案与结果见表2。

2.2.2 回归分析 用Design-Expert 8.0.6设计软件拟合表2中的实验数据，得到二次多元回归方程模型：

Y=3.47+0.30A+0.031B+0.12C+0.057AB-0.18AC+0.048BC-0.73A2-0.094B2-0.14C2

表2 响应面试验方案与结果

由表3可知，P<0.0001方程的模型显著性非常高，即模型是有意义的。模型缺失项为0.049，说明所拟合回归方程与实际情况吻合较好，模型能较好地反映南五味子中五味子甲素的实际试验值，即该模型可用于南五味子甲素含量的分析和预测与最佳提取工艺的确定。

表3 回归模型系数的显著性检验结果

注：* 表示不显著；** 表示显著；***表示极显著。

由表4可知，相关系数R2=0.9987，说明该回归模型不能解释0.13%左右的变异，可以解释99.87%的响应值变化。因此该模型与实际情况吻合较好；C.V(变异系数)=0.846%，表明回归模型能很好反映实际的实验值，南五味子中五味子甲素的优化提取工艺可以通过该方程来确定。

表4 回归模型方差分析

2.2.3 响应面分析 由图6可知，当提取温度一定时，南五味子甲素得率随提取时间延长而增大，当提取时间在2.1～2.3 h时，南五味子甲素得率达到最大，若提取时间继续延长，南五味子甲素的得率又呈现逐渐下降的趋势；当提取时间一定时，提取温度在85～90℃时，南五味子甲素得率最高。因此，适当的提取温度和提取时间对获得较高的五味子甲素得率具有重要意义。

由图7可知，当提取温度一定时，乙醇体积分数在85%左右南五味子甲素得率最高；当乙醇体积分数一定时，可得到较高南五味子甲素得率的提取温度为85～90℃，之后南五味子甲素得率会随提取温度的升高而降低。由此可知，适宜的乙醇体积分数与提取温度对获得的南五味子甲素得率也比较重要。

由图8可知，当提取时间一定时，获得较高南五味子甲素的乙醇体积分数为85%～90%；当乙醇体积分数一定，提取时间在1.9～2.3 h时，南五味子甲素得率最高。因此可知，在进行试验的水平范围内，适宜的乙醇体积分数在合适的提取时间下可获得较高的南五味子甲素得率。

2.2.4 验证试验 通过回归模型预测得出南五味子甲素提取最佳工艺：乙醇体积分数85.07%，温度87.68℃，时间2.12 h，即得到3.591 mg·g-1预测响应值。综合考虑优化工艺和操作可行性，选择验证试验的条件：料液比1∶10、提取温度88℃、85%的乙醇热提2.0 h，得出与理论值的偏差仅为0.064 mg·g-1的响应值3.527 mg·g-1。

2.3 大孔树脂初步分离纯化结果与分析

表5 AB-8型大孔树脂分离纯化南五味子甲素结果

大孔树脂是利用其多孔结构与有机聚合物形成氢键，并借助范德华力选择性吸附不同大分子，以达到分离纯化有效成分的吸附材料[22]。笔者研究选择极性弱的AB-8型大孔树脂，由表5分析可知南五味子中的五味子甲素经AB-8型大孔树脂分离纯化后，其纯度比纯化前提高了30.98%。

2.4 抑菌试验及最低抑菌浓度的测定结果与分析

2.4.1 初步分离纯化前后抑菌活性对比 由表6分析可知，商洛南五味子甲素对四种供试菌均有抑制作用，且南五味子甲素经AB-8型大孔树脂分离纯化后，抑菌能力明显提高，抑菌效果优于分离纯化前。

2.4.2 抑菌试验结果与分析 由表7分析可知，南五味子甲素对枯草芽孢杆菌抑制效果最好，抑菌圈大小最高达21.4 mm，其次为金黄色葡萄球菌和大肠埃希式菌，最后是变形杆菌。并且浓度越小，在一定范围内，抑菌圈直径越小，抑菌效果也越低。

表6 南五味子甲素初步分离纯化前后抑菌活性对比结果

注:—表示无法测出抑菌圈直径(即无抑菌活性)。

表7 南五味子甲素对四种供试菌种的抑菌结果

2.5 复合防腐保鲜液对香蕉保鲜的试验结果

2.5.1 不同处理对香蕉果实烂果率变化分析 图9表明，香蕉果实的烂果程度随着贮藏时间延长而增加，南五味子甲素具有抑菌、抗氧化等活性，在一定程度上抑制了香蕉在后熟期的腐败变质，因此香蕉果实经南五味子甲素复合防腐保鲜液(处理C)涂膜处理后在贮藏过程中出现烂果率最低的趋势，至贮藏7 d时，烂果率为74.47%。

2.5.2 不同处理对香蕉果实失重率变化分析 图10表明，随贮藏时间延长，各个不同处理的香蕉果实重量都有损失，但经防腐保鲜涂膜处理的损失较少；在贮藏前4 d，最明显的是南五味子甲素复合防腐保鲜液(处理C)的保鲜作用，这个处理在贮藏7 d的失重率只有7.49%，比空白对照组的9.31%明显低。

2.5.3 不同处理对香蕉果实硬度变化分析 图11表明，在贮藏过程中，香蕉果实硬度持续下降，贮藏最初变化不明显，后期下降速率则比较快。在贮藏7 d时，五味子甲素复合防腐保鲜液(处理C)的作用效果最为明显，香蕉果实硬度高达6.35 kg·cm-2，对照组的硬度低至2.24 kg·cm-2，基本失去了食用价值。

2.5.4 不同处理对香蕉果实pH值变化分析 图12表明，贮藏时间越长，处理组和空白对照组香蕉果实的pH值均会有明显的上升趋势；同期相比可知，在一定程度上防腐保鲜涂膜层阻碍了香蕉果实的呼吸作用，从而抑制了酸碱值的改变速率，南五味子甲素复合防腐保鲜液(处理C)的pH值上升速率最慢，7 d时为5.54，空白对照组的pH值则上升最快，为5.63。

3 结论与讨论

3.1 结论

(1)选择单因素和响应试验研究得出商洛南五味子甲素优化提取方案：料液比1∶10、提取温度88℃、85%的乙醇热提2.0 h，南五味子甲素得率为3.527 mg·g-1。

(2)商洛南五味子甲素对供试菌种均有一定的抑菌效果，但经过AB-8大孔树脂纯化后的抑菌效果更好，抑菌效果顺序：变形杆菌<大肠杆菌<金黄色葡萄球菌<枯草芽孢杆菌。在一定浓度梯度内，浓度越低，抑菌圈直径越小，抑菌效果也越弱。

(3)新鲜后熟期香蕉经制备的复合防腐保鲜液处理后，烂果率、pH值、硬度、失重率等检测指标比空白对照组的贮藏保鲜效果强。不同配比的防腐保鲜液对香蕉均具有明显的保鲜效果，0.15%防腐保鲜液能够延长后熟期香蕉的贮藏时间，且与壳聚糖复配后贮藏效果更佳，能有效延长市售香蕉的保藏时间，从而提高香蕉的食用品质与食用价值。笔者试验模拟新鲜后熟期香蕉最易腐败变质的温度和湿度，日常的保藏条件优于试验条件，因此在实际生活中保藏时间将长于笔者试验的保藏时间。

3.2 讨论

(1)研究采用响应面优化乙醇热浸法提取南五味子中五味子甲素，与其他溶剂提取法相比其工艺操作简单，适宜于批量化处理，可节约成本，有利于资源的充分利用。实验所得南五味子中五味子甲素得率低于理论存在值，原因一是采摘时恰逢雨季，延误了最佳采收时期，由于过熟而导致有效成分损失；原因二是提取工艺有待进一步优化，有研究表明乙醇回流法和超临界CO2萃取所得的南五味子甲素的得率均高于乙醇热提法[23]。

(2)研究是在实验室条件下所取得的有关南五味子甲素提取的工艺参数，鉴于实验时间、条件所限，只是对五味子甲素提取液用AB-8型大孔树脂进行了初步纯化，仍含有部分杂质。商洛南五味子甲素提取物对四种标准供试菌的生长均有一定抑制作用，但与提纯效果较高的相关试验存在一定偏差[24]。因此，南五味子甲素最优的分离提纯方法，最佳的抑菌浓度等，还有待进一步研究讨论。

(3)南五味子作为商洛市重点发展的“五大商药”之一，亟待多方面的开发利用。南五味子甲素能有效抑制常见腐败菌及致病菌在环境中的繁殖生长，从而使食品的保质期得到延长，可作为天然防腐剂在食品的保鲜中加以应用。笔者研究首次利用南五味子甲素复配成防腐保鲜液并用于香蕉防腐保鲜，今后可进一步研究南五味子甲素对霉菌及真菌的抑菌性能、作用机制等，以便更好地为商洛南五味子用于天然食品保鲜剂的研发提供参考依据。