绵羊卵巢卵泡FoxO1表达模式的研究

韩 琦，党文庆，郭翔宇，李雅婷，秦小伟，李鹏飞，吕丽华*

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801；2.山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801）

Weigel[1]等在果蝇中首次发现了forkhead（fkh）基因，并证明了该基因编码的蛋白是细胞核中的一种转录调节因子。FoxO转录因子是叉头框转录因子（Forkhead Transcription Factors）的一个亚家族。FoxO亚家族蛋白在细胞分化、细胞代谢、细胞周期阻滞、细胞凋亡、氧化应激应答和细胞自噬等方面有着重要作用[2]。在哺乳动物中，FoxO亚家族包含FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6 4个成员，他们都具有高度同源性[3]。其中FoxO1、FoxO3和FoxO4广泛表达于全身各个组织中，而FoxO6主要表达在脑的特定区域[4]。有研究发现，FoxO1mRNA在卵巢中表达丰富[5]；Richards等[6]、Shi等[7]、Park等[8]都发现FoxO1高表达于大鼠卵巢的生长卵泡的颗粒细胞中。此外，用FoxO1抗体对荷斯坦奶牛[9]、香猪[10]的卵巢卵泡细胞进行免疫组织化学时，均发现FoxO1在不同的发育阶段的卵泡颗粒细胞中表达不同。Tarnawa等[11]通过对多种哺乳动物进行免疫组化，不仅发现了FoxO1在多种哺乳动物的卵巢颗粒细胞中均有表达，还发现在不同动物卵泡不同的发育阶段，颗粒细胞上的FoxO1表达不同。此外，有研究报道，FoxO1可以促进小鼠[12]、猪[13]、牛[14]卵泡颗粒细胞的凋亡，这说明FoxO1对卵泡颗粒细胞的增殖具有一定的调控作用。颗粒细胞是卵泡内十分重要的细胞群，颗粒细胞的增殖、分化、凋亡及激素分泌与卵泡的发育密切相关[15-16]。由此可见，FoxO1对卵泡的发育有一定的调控作用。近年来对FoxO1的研究大多集中于小鼠、猪、牛等哺乳动物，尚未见过有关于绵羊的报道。本实验主要是通过免疫组织化学定位、qRT-RCR和Western Blotting技术检测FoxO1在绵羊不同大小卵泡中的表达规律，为进一步探明FoxO1在绵羊卵巢卵泡中的调控作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本实验选用的健康性成熟绵羊（生理状况一致）卵巢均来自山西省晋中市清徐县绵羊屠宰场。

1.2 主要试剂 RNAiso Plus（TaKaRa，日本）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本）、TB GreenTMPremix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa，日本）、RIPA裂解液（碧云天，上海）、PMSF（博士德生物，武汉）、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（Solarbio，北京）、Lane Marker Loading Buffer（Reducing 5×）（康为世纪生物科技有限公司，北京）、M5 Prestained Protein Ladder（10～180 ku）with 45 ku（聚合美，北京）、封闭蛋白干粉（博士德生物，武汉）、Rabbit HRP Kit（DAB）（康为世纪生物科技有限公司，北京）、4%多聚甲醛（博士德生物，武汉）、苏木素（博士德生物，武汉）、FoxO1 Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，美国）、β-actin polyclonal antibody（BioWorld，美国）、IRDye800CW Goat anti-Rabbit（LI-COR，美国），其余均为国产分析纯试剂。

1.3 实验方法

1.3.1 绵羊小中大卵泡以及卵泡颗粒细胞的分离 将采集的健康绵羊（生理状况一致）卵巢放入4℃杜氏磷酸缓冲液（DPBS）中，快速带回实验室并处理，将卵巢用灭菌的DPBS冲洗2遍后，用眼科剪将卵泡从卵巢上分离出来，并按照Nogueiraa等的卵泡分类方法将卵泡分为小（直径≤3 mm）、中（3 mm＜直径＜5 mm）、大（直径≥5 mm）3类[17-19]，灭菌的DPBS冲洗2次后放入盛有DPBS的表面皿上，将卵泡剪开并用刮刀轻刮卵泡内壁，收集带有颗粒细胞的DPBS，1 400 r/min离心7min，弃上清，-80℃保存。

1.3.2 免疫组织化学 将采集的大中小卵泡放入4%多聚甲醛中固定24 h，经过脱水、透明、浸蜡和包埋后制成6 μm的切片，然后按照Rabbit HRP Kit（DAB）试剂盒说明书对切片进行免疫组化，其中FoxO1抗体以1:100的比例进行稀释，一抗4℃孵育并过夜（12～16 h），同时设置阴性对照，FoxO1抗体用PBS代替。DAB显色成功后，自来水冲洗终止显色，苏木精复染60 s，自来水反蓝，经过脱水透明后用中性树脂封片，最后使用Olympus生物显微镜进行镜检观察并拍照。

1.3.3 绵羊卵泡颗粒细胞总RNA的提取与反转录 将大中小卵泡颗粒细胞从-80℃取出，按照Trizol法分别提取大中小卵泡颗粒细胞的总RNA。之后用核酸蛋白测定仪测定RNA浓度。

按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明合成cDNA链。第一步：向离心管中加入1 μL gDNA Eraser、2 μL 5×g DNA Eraser Buffer、1 μL总RNA、6 μL RNase Free dH2O，充分混匀后，置于PCR仪，反应条件为42℃ 2 min；去除gDNA。然后再加入1 μL Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ，4 μL 5×Prime Script BufferⅡ，1 μL RT Prime Mix，4 μL RNase Free dH2O，混匀后，置于PCR仪，反应条件为37℃ 15min；85℃ 5 s；-20℃保存备用。

1.3.4 引物设计与合成FoxO1引物来自参考文献[20]；以18S基因作为内参基因，引物均由华大基因合成，引物序列见表1。

1.3.5 qRT-PCR 以之前合成的cDNA为模板，根据TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒的说明，建立20 μL的反应体系：扩增基因的上、下游引物各0.8 μL(0.4 μmol/L)，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2X)10 μL，cDNA模板1 μL，RNase Free dH2O 7.4 μL。反应条件：95℃ 30 s（预变性阶段）；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，共45个循环（PCR反应阶段）；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s（熔解曲线阶段）。

表1 荧光定量PCR引物序列

1.3.6 绵羊卵泡颗粒细胞总蛋白的提取和Western Blotting

1.3.6.1 总蛋白的提取 将PMSF和RIPA裂解液以1:100的比例混匀，必须现配现用。将配好的溶液分别加入盛有大中小卵泡颗粒细胞的离心管中。冰上静置30 min，4℃ 10 000×g离心5 min，取上清，测蛋白浓度并于-80℃保存。

1.3.6.2 Western Blotting 根据SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明和所测蛋白的分子量大小，制备8%的分离胶和5%的浓缩胶。根据所测蛋白的浓度计算蛋白上样量。蛋白和蛋白示踪上样缓冲液以4:1的比例混匀，之后在100℃的金属浴中变性5 min。点样后80 V 30 min浓缩胶电泳；120 V 100 min分离胶电泳。电泳完毕后，将所需的胶切下，剪取与胶大小一致的NC膜，按照“黑板+海绵+滤纸+胶+NC膜+滤纸+海绵+白板”顺序放好，装入转膜槽，100 V 90 min进行转膜。转膜结束后，将NC膜放在盛有5%的封闭蛋白干粉溶液中封闭1 h。封闭结束后，进行一抗孵育，4℃过夜，FoxO1兔单克隆抗体和TBST以1:900的比例稀释，β-actin兔多克隆抗体和TBST以1:12 000的比例稀释。一抗孵育结束后用TBST洗3次，每次10 min。荧光二抗室温孵育1 h，注意避光，荧光二抗和TBST以1:18 000的比例稀释，结束后用TBST洗3次，每次10 min，再用TBS洗10 min。使用Odyssey CLx对NC膜进行曝光。

1.4 统计分析 qRT-PCR检测结果采用2-ΔΔCT法计算目的基因的mRNA表达量，各基因表达量均经内参18S校正。Western blotting检测结果用Image J软件分析。所有数据至少重复3次。采用SPSS 22.0对数据进行单因素方差分析和显著性检验分析，结果均以平均值±标准差表示。使用Graphpad Prism 7.0（Monrovia，美国）软件作图。

2 结果

2.1 FoxO1在绵羊大、中、小卵泡中的免疫组织化学定位分析 绵羊卵巢卵泡经过FoxO1免疫组织化学定位，结果如图1所示，FoxO1蛋白在绵羊卵巢卵泡中有表达，在实验组中，阳性着色良好，呈黄色或者较深的棕黄色（图1-A、1-B、1-C）。同时，阴性对照中无特异性着色（图1-a、1-b、1-c）。与阴性对照组相比，阳性对照区集中在颗粒细胞层，说明FoxO1蛋白在绵羊卵巢卵泡颗粒细胞中表达。另外，可以发现中卵泡的阳性染色最强，小卵泡次之，大卵泡的阳性染色最弱，几乎没有。

2.2 绵羊大、中、小卵泡颗粒细胞中FoxO1mRNA表达如图2所示，中卵泡内FoxO1mRNA的表达量高于小卵泡与大卵泡（P＜0.01），小卵泡FoxO1mRNA的表达量高于大卵泡（P＜0.01）。

2.3 绵羊大、中、小卵泡颗粒细胞中FoxO1蛋白表达用Western blotting检测FoxO1的表达，以β-actin为内参，结果发现FoxO1在不同大小的卵泡中的表达量不同（图3-A），中卵泡的条带较粗较浓。经过对其进行灰度值分析（图3-B）可发现，大卵泡的FoxO1蛋白表达量与中卵泡和小卵泡存在极显著差异，而小卵泡和中卵泡的FoxO1蛋白表达量差异不显著。

3 讨 论

哺乳动物卵巢内卵泡发育过程受到多种内分泌、旁分泌、自身调节因子以及环境的协同作用。绵羊卵泡的发育是以卵泡波的形式进行，绵羊每个卵泡波是以1个或1组卵泡直径从3 mm生长到大于等于5 mm的过程[19]。一个卵泡波由募集期（生长卵泡池中的一部分卵泡率先生长）、选择期（大多数卵泡闭锁退化，只有少数继续生长发育的过程）和优势期（在被选择的卵泡中有一个或几个能够快速发育到排卵而其他卵泡的发育受到抑制的过程）组成。据研究报道，将绵羊卵泡按直径大小划分为小卵泡（直径≤3 mm）、中卵泡（3 mm＜直径＜5 mm）、大卵泡（直径≥5 mm）[17]，小卵泡可看作卵泡发育的募集期，中卵泡可看作卵泡发育的选择期，大卵泡可看作卵泡发育的优势期[18]。FoxO1已经在多种哺乳动物的卵泡中被定位[11]，同时在小鼠[12]、大鼠[8]、猪[13]、牛[14]的卵泡颗粒细胞上检测到FoxO1的表达。本研究在绵羊卵泡颗粒细胞上也检测到FoxO1的表达。

FoxO1在颗粒细胞的增殖、卵泡的发育、闭锁和黄体化中扮演重要角色[21]。据研究报道，FoxO1在小鼠、猪、牛的卵泡颗粒细胞和膜细胞上都有表达，在牛的卵母细胞上也检测到了FoxO1的表达[11]。丁威[22]用抗FoxO1抗体对二花脸猪卵巢组织进行免疫组化时，发现FoxO1在卵泡的颗粒细胞和卵母细胞胞质中都有表达。而本研究免疫组化结果显示FoxO1只在卵泡颗粒细胞层表达，这说明FoxO1的表达可能具有物种差异性。另外，本研究荧光定量和Western blotting的结果表明，FoxO1在中卵泡颗粒细胞中表达量最高，小卵泡颗粒细胞次之，大卵泡颗粒细胞表达最少，这提示FoxO1在颗粒细胞的增殖和凋亡中可能起着重要作用。申明[12]和李然[23]在过表达FoxO1后都发现小鼠卵泡颗粒细胞的凋亡水平显著增加。Gebremedhn等[14]用FoxO1siRNA转染牛颗粒细胞后FoxO1mRNA水平和FoxO1蛋白水平都显著降低，同时会促进颗粒细胞增殖，这表明FoxO1在牛颗粒细胞增殖中有重要作用。李烈川[13]用过氧化氢处理猪卵泡颗粒细胞0～6 h后，发现FoxO1磷酸化水平的变化和细胞自噬活性的变化相一致，说明FoxO1可能参与了猪卵泡自噬的调节。申明[12]研究也表明FoxO1在氧化应激引起的小鼠卵泡颗粒细胞凋亡中发挥了关键的促凋亡效应。这些都表明FoxO1对颗粒细胞的调控作用。近年来，研究表明FoxO1作为一种肿瘤抑制因子参与肿瘤的发生发展[24-25]。其中，Zhang等[25]研究发现戈舍瑞林可能通过PI3K/Akt信号通路上调FoxO1蛋白的表达来促进卵巢癌细胞凋亡。以上都表明了FoxO1在细胞中的促凋亡作用。本研究FoxO1在中卵泡颗粒细胞中高表达，而中卵泡又是决定卵泡走向闭锁或是走向优势卵泡的关键阶段，说明FoxO1在这个阶段发挥关键调控作用。结合前人的研究分析，FoxO1可能促进颗粒细胞凋亡，而颗粒细胞的凋亡是导致卵泡发生闭锁的重要原因[26]，因此，FoxO1在卵泡发育中有重要作用。

卵泡不仅存在卵泡直径的分级还有类固醇激素生成量变化的不同，随着卵泡的生长发育卵泡内的雌激素不断增多，卵泡直径与其卵泡液中的雌激素水平呈显著正相关[27]。陈阿琴[19]用酶联免疫吸附法检测湖羊卵泡中雌二醇浓度，发现绵羊的成熟卵泡（＞5 mm）卵泡液中的雌二醇浓度与生长卵泡（3～5 mm）相比显著增高。另外，本实验室前期工作已证明绵羊大卵泡内雌激素含量显著高于中卵泡[18]。而本实验结果显示大卵泡的FoxO1表达量显著低于中卵泡，这说明卵泡由中卵泡发育到大卵泡的这个阶段，FoxO1可能与雌激素的生成有关。而且已有研究表明，FoxO1会降低小鼠体内CYP19A1mRNA的表达[28]，而CYP19A1是雌激素合成的关键酶[29]，所以FoxO1有可能通过CYP19A1调控雌激素的合成。但Richards等[6]研究表明，大鼠体内注射雌激素后，大鼠卵泡颗粒细胞中FoxO1mRNA和蛋白的表达增加。这说明雌激素会促进FoxO1的表达，这与本实验结果相矛盾，可能是由于不同物种间存在差异性，或者有其他分子机制的影响。从实验结果可以初步判断FoxO1在绵羊卵泡的生长发育中起着重要作用，但是FoxO1对绵羊卵泡颗粒细胞的作用机制还有待于进一步研究。

4 结 论

本实验结果表明，绵羊卵泡颗粒细胞中有FoxO1的表达，且在卵泡的不同发育阶段FoxO1的表达量不同，大卵泡中的表达量极显著低于小卵泡和中卵泡，提示FoxO1可能参与绵羊卵泡发育的调控。