电化学发光法测定鳞状上皮细胞癌抗原的性能验证

杜秀环，陶 耕

福建医科大学附属第二医院检验科，福建泉州 362000

鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)是1977年由KATO等[1]从子宫颈鳞状上皮细胞癌组织分离的TA-4的一个亚片段，TA-4是相对分子质量为48×103的糖蛋白，该蛋白是一种癌抗原。SCCA以SCCA1和SCCA2两种亚型存在,两种亚型均在肺、外阴、宫颈下部、食管和皮肤的鳞状上皮细胞中共同表达，而且均可在血清中被检测到。在鳞状上皮细胞癌(SCC)，特别是肺癌、宫颈癌患者血液中两种SCCA亚型水平均有升高。近年来众多文献表明，SCCA血清水平与肺癌和宫颈癌的肿瘤分期、大小、治疗后残余肿瘤、复发或进展、生存率相关[2-4]。德国罗氏诊断公司近来推出电化学发光法检测SCCA试剂盒，本实验室拟开展此项目，根据ISO15189实验室认可的要求[5]，验证检测系统的基本分析性能符合本实验室及临床需求，与厂家资料一致，才可用于临床检测。因此,本实验室对罗氏电化学发光法检测SCCA的精密度、正确度、线性范围、参考区间及可报告范围进行验证,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年8月1日至11月30日在本院就诊的患者和健康体检者血清，标本无溶血、黄疸及乳浊。

1.2仪器与试剂 罗氏公司Cobas e601全自动电化学发光免疫分析仪，所用试剂为其原装配套试剂(批号32267301)、标准品(批号33315501)、质控品(批号29984599)。

1.3方法

1.3.2正确度验证 根据CLSI EP15-A3文件要求[6]，选择德国罗氏公司提供的具有定值的两种浓度质控品，连续检测3次，取平均值，计算其绝对值和相对偏差，绝对值=测定值-靶值，相对偏差=绝对值/靶值×100%。若相对偏差<1/2允许总误差(TEa),结果可接受，其正确度被认可。

1.3.3线性范围验证 根据NCCLS EP6-A文件要求[7]，选择低浓度(L)和高浓度(H)两种浓度的患者标本各1份，并且要求其分别接近厂家提供的参考范围的下限和上限，按5L、4L+H、3L+2H、2L+3H、L+4H、5H配制成6种浓度的血清，每种浓度的血清连续检测2次，取其平均值作为实测值，并计算每种浓度的预期值。判断标准：将实测值与预期值进行回归统计，若斜率在0.97～1.03,r2≥0.975 0，则为线性范围验证通过。

1.3.4参考区间验证 选择本院健康体检者血清标本20份，男女各10份，年龄18～65岁。参考NCCLS C28-A2文件[8]，如果20例受试者中≤2例的检测结果不在厂家提供的参考区间内，则说明本实验室可直接引用试剂说明书提供的95%置信区间。

1.3.5可报告范围验证 收集临床高值标本1份，其浓度为60 ng/mL,用厂家配套的稀释液分别以1∶2、1∶4、1∶8、1∶16进行手工稀释，并重复检测2次，取其平均值，同时将高值标本原倍检测2次，取其平均值作为标本靶值。根据稀释倍数计算其目标值，回收率=测定均值/目标值×100%，回收率允许误差为80%～120%。回收率在允许误差范围的最大稀释比例参考临床可报告范围上限计算。可报告范围上限=最大稀释倍数×标本靶值。

1.4统计学处理 采用Excel 2007软件及SPSS21.0软件进行数据统计分析处理，计算相关系数和回归分析。

2 结 果

2.1精密度验证 见表1。SCCA低值和高值质控血清批内CV分别为2.19%、1.20%，均小于厂家试剂说明书的5.00%、6.50%；批间CV分别为5.43%、2.72%，符合厂家提供的批间CV<10.00%。

表1 批内及批间不精密度比较

2.2正确度验证 见表2。SCCA低值和高值质控血清测定均值均在允许范围内，其相对偏差分别为3.68%、0.98%，相对偏差均小于1/2TEa,验证通过。

表2 正确度验证结果

2.3线性范围验证 不同浓度范围血清检测均值与理论值见表3，以理论值为Y，实测值为X进行回归分析得线性方程：Y=1.020 3X-0.277 9,r2=0.998 5，见图1。其斜率为0.97～1.03,r2>0.975 0,验证试验得出的线性范围为0.14～58.12 ng/mL，与厂家说明书提供的结果(0.10～70.00 ng/mL)比较一致。

表3 线性范围验证结果(ng/L)

2.4参考区间验证 厂家试剂说明书提供的中国健康个体95%参考范围为2.7 ng/mL(95%CI:2.2～3.3 ng/mL),此次验证试验20例健康体检者SCCA检测值为0.98～2.01 ng/mL，均在厂家声明的参考区间范围内，说明实验室可直接引用厂家提供的参考区间。

图1 线性范围回归分析

2.5可报告范围验证 收集到的临床高值标本浓度及其各稀释梯度的检测结果见表4，各稀释梯度检测结果的回收率均在80%～120%，最大稀释比例为1∶16，可报告范围上限为59×16=944.00 ng/mL。

表4 可报告范围验证结果

3 讨 论

SCCA的生物功能是抑制酶活性，SCCA1能抑制木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶，SCCA2能抑制糜蛋白酶类丝氨酸蛋白酶、组织蛋白酶G和胃促胰酶。在正常鳞状上皮细胞中，SCCA可抑制细胞凋亡和参与鳞状上皮分化，而在鳞状上皮细胞癌中，其参与肿瘤细胞的生长增殖[9-10]，是反映鳞癌生物学特性的重要肿瘤标志物之一。目前，SCCA已广泛应用于鳞癌特别是肺癌和宫颈癌的疾病诊断、病情监测及疗效评价。

目前，用于检测SCCA的免疫放射法因放射性同位素的辐射影响已逐渐遭到淘汰，而ELISA重复性差，操作复杂，线性范围窄，现较多实验室使用的是精确度高、检测快速的化学发光免疫分析法。电化学发光免疫分析是继放射免疫分析、酶联免疫分析、荧光免疫分析和化学发光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术，该方法灵敏度高、特异性强且检测快速，为免疫诊断提供了一个新方向。电化学发光法检测SCCA能以等摩尔方式检测人血清和血浆中SCCA总量(SCCA1和SCCA2)。根据ISO15189：2007《医学实验室质量和能力认可准则》要求，临床实验室在使用新的检测试剂或系统时，应对厂家声明的各项性能指标进行验证。本研究主要针对电化学发光法检测SCCA的精密度、正确度、线性范围、参考区间及可报告范围进行验证。

在正确度验证试验和精密度验证试验中，本研究均采用了试剂配套的质控品。正确度是检测结果与被测量物真值之间的接近程度，以偏差来表示，偏差越大正确度越差。在正确度验证检测中，将检测结果与厂家给定的质控品靶值进行比较，其低值与高值检测结果均在允许范围内，相对偏差分别为3.68%和0.98%，均小于1/2TEa，表明该检测系统性能良好，正确度较高。精密度是在规定条件下获得的独立测量结果之间的接近程度，通常用CV表示。在该验证试验中，SCCA低值与高值质控品批内CV分别为2.19%、1.20%，批间CV分别为5.43%、2.72%，均小于厂家提供的参数。低值SCCA批间CV相对较高，可能与其浓度较低及挥发有关。

线性范围是整个检测系统对应于系列分析浓度的仪器最终输出的信号间是否呈恒定比例的性能，是一项很重要的检测系统性能分析指标。每个实验室的检测系统实际条件各不相同，因此，应建立自己的线性参数，不应该直接引用厂家的线性范围。本研究的线性范围为0.14～58.12 ng/mL，与厂家说明书提供的0.10～70.00 ng/mL比较一致，因此高于此检测上限的标本应进行稀释后再测定，才能得到可靠的结果。由于各个地区环境、人们生活习惯等不同，因此生理生化指标也不同，推荐每个实验室应根据目标人群建立各自的期望参考范围。由于试剂成本较高，以及各方面因素限制，本实验室拟采用试剂说明书提供的参考区间并进行验证。本研究选取的20例健康个体SCCA检测结果均在厂家提供的参考区间内，因此，本实验室可直接引用试剂说明书提供的95%置信区间。在可报告范围验证中，由于可收集到的高值标本受限，只收集到60.00 ng/mL标本1例，用此标本进行验证得到SCCA的可报告范围上限为944.00 ng/mL。

综上所述，电化学发光法检测SCCA的主要性能指标达到了厂家说明参数或相关指标，能满足临床检测的要求，可用于临床检测。