股骨头坏死的代谢组学研究进展

先丹丹，卢发强

（大连大学 附属中山医院，辽宁 大连 116001）

股骨头坏死即缺血性骨坏死(Avascular Necrosis of the Femoral Head，AVNFH)，是由于股骨头的血供受损或者中断，引发的骨细胞及其骨髓成分凋亡，随后组织进行修复，最终使股骨头的结构发生变化，甚至出现塌陷和髋关节破坏，从而引发一连串病理生理改变和临床表现[1,2]。该病是骨科的常见疾病，美国有30 万至60 万人患有非创伤性股骨头坏死(Non-traumatic Osteonecrosis of the Femoral Head，NONFH)，从20 世纪90 年代开始，美国平均每年增加1 万至2 万的新病例[3-5]。根据在2012 年6 月至2013 年8 月选出的代表性样本中，我国NONFH的总体患病率是0.725%[6]。按照我国最新人口调查数据显示，15 岁以上人群(包括15 岁)中有800 多万人口患有NONFH[7]。ONFH 可分为创伤性股骨头坏死和NONFH。前者的病因明确，后者主要包括长期大量使用激素、长期饮酒、凝血功能障碍、自身免疫性疾病等[8]。但是ONFH 的发生机制目前还未完全明确，各国学者提出了多种理论：脂质代谢紊乱理论、血管内凝血理论、基因多态性理论、骨内压增高理论、骨质疏松理论等[9,10]。由于ONFH的自然进程较快，如果不进行早期诊断和治疗，最终患者需要进行髋关节置换术，严重影响患者生活质量水平。该病的诊断主要依靠临床表现、体征及影像学检查(X 线、CT、MRI 等)，但X 线、CT 不足以用于早期诊断，MRI 用于早期诊断有较好的灵敏度，但是其价格昂贵，故较难用于早期筛查，导致ONFH 早期诊断较为困难[11]。代谢组学是系统生物学的重要构成部分，是近年来飞速成长的一门新技术，被广泛用到疾病诊断[12]、药理学[13]、营养学[14]、微生物学[15]、食品科学[16]等各个领域，在生命科学领域中表现出巨大的作用。将代谢组学用于ONFH 的研究，有利于该病的早期诊断。

一、代谢组学概念

随着后基因时代的到来，人们对生命有了更加深刻的认识，研究重点慢慢转移到几个组学(转录组学、蛋白质组学和代谢组学)上来，他们共同构成了系统生物学。Nicholson 等[17]认为基因以及蛋白质组学忽略了生物体内的动态代谢情况，因此在20 世纪90 年代末提出了一种基于NMR 的“代谢组学”技术，将其定义为“定量测定由于机体受到各种病理生理干扰或者遗传变化而造成的动态代谢反应”。后来常将代谢组学解释为通过检测生物体受到内外环境干扰或变化后，其代谢物的种类、量以及规律发生改变，从而探索生物体的一门科学[18]。代谢处于生命调控的尾端，上游生物的破坏可导致下游一系列代谢物发生变化，因此，代谢组学拥有大量的信息，较其他组学而言，更接近于表型，因此它的最终目标是尽可能地全盘解析体内的小分子代谢物。该组学可以分成两种方法[19,20]，即靶向和非靶向代谢组学。非靶向是尽可能对标本中所有可能测到的代谢物进行全盘分析，其中包含未知的，为找到新的靶标给予机会；而靶向代谢组学旨在对样本中某一类或几类特定代谢物进行检测分析，这有助于降低后续实验和数据分析伪像的可能性。

二、代谢组学研究方法

代谢组学的流程包含了标本的收集及预处理、数据信息的获取及预处理、数据的多元统计分析、标志物的鉴别以及对代谢通路的阐述等[21]。将收集的样本如血浆、血清、尿液、粪便、唾液、胸腹水、脑脊液、组织等进行预处理，然后运用核磁共振(NMR)、液相色谱-质谱(LS-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)或高效液相色谱法(HPLC-MS)等[22]技术对数据信息进行收集，收集完成后不能立刻开始模式识别，需要对其实行预处理，一般包含峰匹配、去噪、峰对齐、归一化和标准化等[23]。该技术获得的信息是多量的、繁琐的，为了充分获取信息，将对数据进行多元统计分析，主要包括非监督学习方法的主成分(PCA)、非线性映射(NLM)和有监督学习方法的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS)、人工神经网络(ANN)等[23]。需要注意的是，监督模型建立之后需要进行模型验证，如置换检验、交叉验证。其中常用的数据处理软件包括SIMCA-P、Sieve、MetaboAnalyst、MarkerLynx、R 软件等[24-28]。根据上述分析，可以结合fold change 值、VIP 值、P 值等来筛选生物标志物。将筛选出的标志物进行数据库检索，对其进行鉴定，常用的数据库有HMDB(http://www.hmdb.ca/)、METLIN(http://metlin.scripps.edu/)、MassBank (https://massbank.eu/)、LIPID MAPS(http://www.lipidmaps.org/data/structure/)、NIST (http://www.nist.gov/srd/nistl.htm)、KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）等[29-34]，同时将所找到的标志物进行代谢途径分析，从而探索疾病的发病机制。

三、ONFH 的代谢组学研究

随着组学技术的日新月异，代谢组学在临床上也得到广泛应用。很多专家利用该技术对ONFH 样本（血浆、尿液或骨组织等）进行分析。目前，代谢组学在ONFH 领域的探索主要涉及生物标志物的鉴定、代谢途径的认识等方面。虽然代谢组学在ONFH 领域已有一定的发展，但是，相关研究仍然面对很多的困难及挑战。

（一）ONFH 的潜在生物标志物

生物标志物的鉴定和代谢途径的分析具有协助疾病诊断及治疗，了解预后和探讨发病机制的潜力。高四川等[35]研究发现并鉴定出28 种差异性代谢物质，同时筛选出三种潜在诊断性生物标志物。Yang G 等[36]筛选出硫酸盐，尿素，脱氧胆酸和PE[14:0/14:1(9Z)]作为ONFH 的生物标志物。Zhu WW 等[37]的研究基于UPLC-MS/MS 筛选出四种股骨头坏死的潜在性生物标志物，四者联合诊断ONFH 的价值较高。经归纳，将相关文献中提到的生物标志物归纳总结于表1[35-38]。ONFH 的生物标记物有利于对疾病进行早期诊断，甚至可以用于对疾病预后的评估，但是目前该研究还居于初级状态，因此还需加大对它的探索。

表1 潜在的生物标志物

保留时间 代谢物 变化趋势 质量 P 值5.61 D-精氨酸 ↑ 174.1116 0.000 7.46 L-脯氨酸 ↑ 115.0633 0.000 7.93 L-谷氨酰胺 ↑ 146.0691 0.000 6.89 L-肉碱 ↑ 162.1051 0.000 6.25 肌苷 ↑ 268.08070.000

（二）ONFH 的代谢途径

1 核苷酸代谢和嘌呤代谢

核苷酸是核酸(DNA 和RNA) 的基本结构单位。嘌呤分解代谢过程中，次黄嘌呤最终将分解为尿酸，在这个过程中会形成氧自由基，具有组织损伤作用[39]。肌苷是腺苷的分解产物，可显著减少脂质过氧化，并增加了还原型谷胱甘肽(GSH)以及超氧化物歧化酶(SOD)的程度，具有抗炎抗氧化作用[40]。ONFH 患者次黄嘌呤水平降低[35]，肌苷水平升高[38]，这些研究可能说明了ONFH 的发生与氧化应激反应密切相关。

2 氨基酸代谢

甲硫氨酸(蛋氨酸，Met)是体内的含硫氨基酸，由于体内无法自动合成，需要由食品提供，因此它属于必需氨基酸。Met 可以转变成其他含硫氨基酸：半胱氨酸以及胱氨酸。在Met 循环中，它可以在各种酶的协助下依次形成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)、同型半胱氨酸(Hcy)、Met。Hcy 主要有两条代谢途径，一条是再甲基化途径：其中转甲基酶的辅酶是VitB12；另一条为转硫途径，其中以VitB6 为辅酶。因此，Hcy 代谢与VitB12、VitB6 水平密切相关。Yang J 等[41]发现Hcy 显著增加了骨折风险。Narayanan A 等[42]研究发现，ONFH 的靶向代谢组学分析揭示了甲硫氨酸-同型半胱氨酸途径代谢物的变化，ONFH 样本中Met、SAM、SAH、Hcy 和腺苷水平显著提高，VitB12 和VitB6 水平下降，这两种维生素作为Hcy代谢的辅酶，进一步说明了股骨头坏死患者体内Hcy 的积累。Yang G 等[36]研究同样也表明ONFH与半胱氨酸和蛋氨酸代谢有关，丝氨酸、硫酸盐和Hcy 在这一途径中受到影响。Hcy 可以增加氧化应激，破坏胶原分子的交联，增加晚期糖基化终产物的水平，从而降低骨强度，增加骨吸收[43]。有研究表明[44-46]，Hcy 水平增高可使破骨细胞活性增加，诱导骨髓基质细胞和成骨细胞凋亡。Fitzpatrick 等[47]发现，靶向破坏小鼠组氨酸脱羧酶(HDC)基因[HDC（-/-）]后，它的破骨细胞数目降低，骨形成增长而骨吸收降低，骨皮层厚度和矿物质含量增长。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是骨代谢尤其是成骨细胞形成的重要调节剂，研究表示[48]，精氨酸(Arg)可以刺激鼠成骨样细胞的IGF-1 和胶原蛋白的形成，通过增强局部IGF-1 的产生来影响骨形成。富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)对于骨骼形成非常重要，而缺乏Pyk2(Pyk2-KO)的雌性小鼠则表现出骨含量增长以及骨骼形成速度加快，而破骨细胞活性降低[49]。由此可见，氨基酸代谢在ONFH 的病理生理中有着不可替代的影响。

3 脂类代谢

肉碱具有多种作用，它不仅可以促进脂肪酸的β 氧化，还可以调控人体中胆固醇(CHOL)的形成和分布，与此同时它还可以改变脂蛋白的成分及比例[50]。研究发现[51]，左旋肉碱(LC)增强了线粒体的活性并改善了成骨样细胞的抗氧化能力，同时LC 增加了Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ，此外，LC 诱导ERK1/2 和AKT 的磷酸化以及成骨细胞分化的主要激酶，并上调了成骨相关基因包括核心结合蛋白因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、骨唾液蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)等，这些都提示了LC 对成骨因子起着上调作用。在ONFH 的研究中，发现肉碱水平升高[37,52]。果糖作为一种单糖，如果过量摄入果糖可能会导致脂质代谢紊乱，其中极低密度脂蛋白(VLDL)以及甘油三酯(TG)水平升高[53]，相关研究发现ONFH 患者果糖代谢水平上调[35]。甘油磷脂主要包括磷脂酰胆碱(卵磷脂、PC)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂、PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油、二磷脂酰甘油(心磷脂、DAG)、磷脂酰肌醇(PI)。破骨细胞如果融合不良可能会影响体内骨骼的完整性，研究发现，破骨细胞形成中细胞融合步骤受PS 调节的几种蛋白质活性的控制[54]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是肌醇和PI 中的一种重要激酶，Akt 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，体内外研究发现，启动PI3K/Akt 细胞信号途径可以增加成骨细胞的繁殖，分化以及骨形成[55]。ONFH中甘油磷脂代谢受到显著干扰[36,37,52]，说明甘油磷脂代谢在股骨头坏死的病理过程中起着至关重要的调节作用。于雪峰等[56]利用代谢组学技术发现游离脂肪酸代谢发生异常也是引起ONFH 的紧要原因。由此可见，更好地了解脂质代谢变化在ONFH 中的所起的作用，有助于探索疾病的发病机制，甚至有可能有助于开发治疗该病的新方法。

4 能量代谢

糖酵解途径中葡萄糖转化为丙酮酸后进入线粒体，经过氧化脱羧形成乙酰CoA，再经过TCA 循环被完全氧化。骨髓间充质干细胞(MSCs)可以进行自身的更新以及多向分化，它可以分化为成骨细胞、软骨细胞等等，其中未分化的骨髓间充质干细胞获能主要依靠糖酵解代谢，而MSCs 向成骨细胞分化过程主要依靠线粒体氧化磷酸化获能[57,58]。3-磷酸甘油酸[36,52]、丙酮酸和乳酸[52]水平降低，可能表明ONFH 的能源供应受到干扰。3-磷酸甘油酸和丙酮酸水平降低，说明了丙酮酸来到线粒体后经过氧化脱羧后产生的乙酰CoA 减少，导致进一步通过TCA 循环时所生成的能量减少。而乳酸以及丙酮酸等还是糖异生过程中的原材料，他们可以通过这个过程转化为葡萄糖再进行糖酵解。这些都说明了ONFH 患者糖酵解和TCA 循环两个能量代谢途径受到了显著干扰。

代谢组学分析结果显示了ONFH 患者的多个代谢途径受到了明显的干扰，主要有核苷酸、嘌呤、氨基酸、脂质、能量代谢等多个途径。但是目前对代谢途径的研究还处于初步阶段，还需要进一步加大对ONFH 患者的代谢途径变化的研究，从而探索ONFH 的发病机制，并积极寻找治疗ONFH 的新靶点。

四、总结和展望

代谢组学是一种新兴的组学方法，它不仅弥补了其他组学在研究中的不足，还在过去的几十年里，在各个领域取得了巨大的进展。由于分析技术和生物信息学的不断进步与发展，代谢组学被广泛作为医学研究中的新兴诊断、探索疾病发病机制、评估预后情况以及治疗新靶点的工具。但是由于代谢组学的起步较晚，从整体水平上看，代谢组学现在还处在成长的初步阶段。由于样品的复杂、仪器的繁琐、没有统一标准化的数据库等使代谢组学面临着重大的困难和挑战。ONFH 是骨科的常见病、多发病和难治性疾病，其病因以及发生机制尚未完全明确，如不早期诊断和治疗，病人将走向髋关节置换这一步，这严重降低了患者及其家人的生活质量水平。目前，代谢组学在股骨头坏死领域取得了一定的研究进展，特别是在股骨头坏死的诊断性生物标志物及代谢途径等方面，这让我们看到了代谢组学在ONFH 领域具有重大的前途。但是，就目前研究情况来看，相关研究报道所涉及的生物标志物不同或生物标志物变化趋势与疾病的发生关系相反等，这可能与研究对象分期、代偿或失代偿、检测样本与技术、数据库等具有差异有关，这也是研究股骨头坏死面临的挑战。相信随着科学技术的不断发展，代谢组学对疾病的探索会有更深一步的发展，从而科学合理地保障人们的生命健康安全。