不同钙磷配比及浓度对多花黑麦草生长特性的影响

徐彦红, 左意才, 席溢, 许钟丹, 李斌

(贵州大学动物科学学院, 贵阳 550025)

Ca作为植物必需的营养元素，有“植物细胞代谢的总调节者”之称，能与作为胞内信使的Ca调蛋白结合，调节植物体的许多生理代谢过程[1-2]。P是植物生长发育不可缺少的营养元素之一，不仅是植物体内许多重要化合物的组分，而且还以多种途径参与植物代谢[3]。多花黑麦草(Loliummultiflorum)为禾本科(Gramineae)一年生牧草，其再生性强、产量高、适口性好、品质优良，众多草食动物喜食，可青饲、调制干草、青贮或放牧利用，是中国西南地区冬闲田栽培的主要牧草之一[4-5]。喀斯特地区特殊的碳酸盐母岩成土背景和气候条件，决定了其土壤有机质含量低、钙(Ca)含量较高、保水保土能力差等特点[6-9]；且土壤中的磷(P)大多以难溶态形式存在，可以被植物直接吸收利用的有效P含量低。因此，喀斯特地区土壤多呈现高Ca、低P的特点，这是制约多花黑麦草生产的重要因素之一。因此，研究喀斯特地区多花黑麦草对高Ca、低P胁迫及不同钙磷比(Ca/P比)的响应，具有重要的理论和应用价值。

关于植物对Ca元素、P元素响应的报道很多。吴鹏飞等[10]研究发现，随着低P胁迫时间的推移，杉木的叶绿素含量发生大规模降低，不同浓度的Ca处理可以缓解低P逆境杉木叶绿体受伤程度，显著提高其光合效率。低P胁迫下高粱的叶绿素和可溶性蛋白含量显著下降，丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化物酶(peroxidase, POD)活性升高[11]。胡枝子在Ca胁迫下，SOD和过氧化氢酶(catalase, CAT)活性随着Ca浓度的增加，呈先降低后增加的趋势，Ca浓度增加到100 mmol·L-1时，SOD和CAT活性降到最低，POD活性变化幅度较小[12]。可见，关于植物对钙磷的响应多集中于单一Ca胁迫或P胁迫，而不同钙磷配比及浓度对植物生长影响的报道鲜少，而不同钙磷配比及浓度对多花黑麦草生长特性的研究，更是未见报道。因此，本研究以多花黑麦草(LoliummultiflorumLamk)为试验材料，采用砂培法，探讨了不同Ca、P处理对多花黑麦草株高、叶宽等形态指标以及光合色素、MDA、脯氨酸(proline, Pro)、SOD活性的影响，以期筛选多花黑麦草栽培的最适Ca、P浓度，解析多花黑麦草应对高Ca、低P环境的生理适应机制，为多年生黑麦草在喀斯特地区的种植提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以多花黑麦草‘安格斯1号’为研究材料，种子购自贵州众智恒生态科技有限公司。

1.2 试验方法

采用砂培法进行种植，石英砂用水浸泡，除去粘土和有机质，至水呈无色透明为止；再用3%盐酸浸泡1周；然后用霍格兰营养液浸泡，每天2次，至pH为中性。将处理好的石英砂装入直径为29.5 cm，深为21.5 cm的花盆中，每盆装砂9 kg。

挑选均匀饱满的黑麦草种子，将其置于2%的H2O2溶液中浸泡10 min进行消毒，再用蒸馏水冲洗6遍，晾干备用，将处理后的种子置床培养。待种子发芽，苗长7 cm以上时，选择高度近似、生长情况相近的幼苗移栽花盆中，移栽深度为2 cm。为确保植株有足够的养分，每周定期为植株浇灌霍格兰营养液。

试验共设置3个Ca/P比，依次为1∶1、2∶1、5∶1，每个Ca/P比设置2个水平，具体配置方法见表1，以不添加Ca、P离子的营养液处理为对照(CK)。每个处理种植3盆，每盆定苗3株。P源为NaH2PO4、Ca源为CaCl2。

表1 不同钙磷处理的钙、磷浓度设置Table 1 Designation of calcium and phosphorus treatments

1.3 测定项目及方法

株高和叶宽于2017年3月31日开始测量，每隔1周测量一次，共测量4周。

光合色素测定参照高俊凤[13]的方法；MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法[14]；Pro含量采用酸性茚三酮法[14]；SOD活性采用NBT光化还原法[15]。

采用隶属函数法综合评价钙磷处理对多花黑麦草生长特性的影响，正相关的指标按Di=(xi-ximin)/(ximax-ximin)计算，负相关的指标按Di=1-(xi-ximin)/(ximax-ximin)计算。

式中Di为不同钙磷处理下第i个指标的隶属函数值，xi为不同钙磷处理下第i个指标的值，ximax、ximin分别为不同钙磷处理下第i个指标的最大值和最小值[16]。

1.4 数据处理与分析

利用Microsoft Excel 2013进行数据整理和绘图，SPSS 20.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同钙磷处理对多花黑麦草形态指标的影响

试验过程中不同钙磷处理的多花黑麦草株高和叶宽结果(表2)显示，不同钙磷处理间株高和叶宽有一定差异。试验结束时，T2处理的株高最大，比CK高16.56%，但没有显著性差异；T3处理多花黑麦草的叶宽最大，比CK显著高75.68%。T1和T2处理比较发现，Ca2+浓度为25 mg·kg-1时，随P浓度的增加，株高呈上升趋势，说明添加P会促进多花黑麦草生长，但4月14日之前叶宽呈降低趋势，而4月14日之后叶宽呈升高趋势。T3、T4和T5处理比较发现，Ca2+浓度为50 mg·kg-1时，随P浓度增加，株高呈现不规则变化；4月14日之前叶宽呈先降低后升高趋势，4月14日之后叶宽呈降低趋势。T2和T4处理比较发现，P浓度为25 mg·kg-1时，随Ca2+浓度增加，株高呈现增加趋势，叶宽变化不规则。T5和T6处理比较发现，P浓度为50 mg·kg-1时，随Ca2+浓度增加，株高呈降低趋势。表明适宜的钙磷浓度对多花黑麦草的生长有促进作用，Ca2+和P浓度分别为25、25 mg·kg-1时最佳。

表2 不同日期(mm/dd)不同钙磷处理的株高和叶宽Table 2 Plant height and leaf width of different calcium and phosphorus treatments at different time(mm/dd) (cm)

2.2 不同钙磷处理对多花黑麦草生理特性的影响

2.2.1不同钙磷处理对光合色素含量的影响 不同钙磷处理的多花黑麦草光合色素结果(表3)显示，不同处理对光合色素的影响存在差异性。其中，T2处理叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均为最大值，且显著高于其他处理(P<0.05)，较CK分别提高了12.22%、10.87%、14.63%。Ca/P比为1∶1时，随着Ca2+、P浓度的提高，T5处理较T2处理的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量显著下降。Ca2+浓度为25 mg·kg-1时，随P浓度增加，T2处理较T1处理的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量均显著上升；Ca2+浓度为50 mg·kg-1时，随P浓度增加，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量呈先显著降低(T3至T4)后显著升高(T4至T5)趋势。P浓度相同时，随Ca2+浓度增加，叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量呈降低趋势(T2至T4，T5至T6)。表明适宜的钙、磷浓度对多花黑麦草的光合作用有促进效果，Ca2+和P浓度分别为25 mg·kg-1、25 mg·kg-1时最佳。

表3 不同钙磷处理对光合色素含量的影响Table 3 Photosynthetic pigment contents of different calcium and phosphorus treatments (mg·g-1)

2.2.2不同钙磷处理对MDA、脯氨酸含量和SOD活性的影响 不同钙磷处理多花黑麦草的MDA、脯氨酸含量和SOD活性结果见图1,可见，CK处理的MDA含量最高，T1、T4、T5、T6处理间无显著性差异，T2、T3处理最低。Ca/P比为5∶1时，随Ca2+、P浓度的增加，T3处理较T1处理的MDA含量显著下降；Ca/P比为2∶1时，随Ca2+、P浓度的增加，T6处理与T4处理的MDA含量没有显著性差异；Ca/P比为1∶1时，随Ca2+、P浓度的增加，T5处理较T2处理的MDA含量上升，但没有显著性差异。Ca2+浓度为25 mg·kg-1时，随P浓度增加，T2较T1的MDA含量显著降低；Ca2+浓度为50 mg·kg-1时，T3、T4、T5处理间MDA含量没有显著性差异。P浓度为25 mg·kg-1时，随Ca2+浓度增加，T4较T2的MDA含量升高，但是没有显著性差异；P浓度为50 mg·kg-1时，T5、T6处理间没有显著性差异。表明Ca和P的缺乏对多花黑麦草造成伤害产生较多的MDA，在低浓度时对多花黑麦草伤害较小，而随着胁迫浓度的增加伤害加重，产生更多MDA。

T2处理Pro含量最高，CK处理最低；Ca/P比为5∶1时，随Ca2+、P浓度的增加，T3处理较T1处理的Pro含量显著降低；Ca/P比为2∶1时，随Ca2+、P浓度的增加，T6处理较T4处理间的Pro含量显著升高；Ca/P比为1∶1时，随Ca2+、P浓度的增加，T5处理较T2处理的Pro含量显著下降。Ca2+浓度为25 mg·kg-1时，随P浓度增加，T2较T1的MDA含量显著升高；Ca2+浓度为50 mg·kg-1时，随P浓度增加，Pro含量先显著降低(T3至T4)后显著升高(T4至T5)趋势。P浓度为25 mg·kg-1时，随Ca2+浓度增加，T4较T2的Pro含量显著下降；P浓度为50 mg·kg-1时，随Ca2+浓度增加， T5、T6处理间的Pro含量差异不显著。表明在高Ca2+、P胁迫下，细胞渗透调节物质辅氨酸含量升高，但T2处理的辅氨酸含量最高，原因还需要进一步研究。

T5处理SOD活性最强，处理T1、T2、T3、T4、T6之间差异不显著，且活性均较低。Ca2+浓度为25 mg·kg-1时，随P浓度增加，SOD活性增强(T1至T2)；Ca2+浓度为50 mg·kg-1时，随P浓度增加，SOD活性呈先降低后显著升高；P浓度相同时，T2、T4处理间SOD活性无显著差异，T6处理较T5处理SOD活性显著下降。表明适当的Ca和P浓度会增加植物SOD活性，但胁迫过重SOD活性降低。

2.3 不同钙磷处理对多花黑麦草生长特性影响的综合评价

通过对上述指标的分析发现，多花黑麦草对不同Ca2+、P浓度存在一定的适应机制，在不同钙磷处理下各生理指标的响应有差异。为探究多花黑麦草适宜生长的Ca/P比及Ca2+、P浓度，采用隶属函数法对不同钙磷处理下各指标进行综合评价。以不同处理下各指标的平均值为基础，用隶属函数综合评价公式，分别计算不同处理下多花黑麦草8个生理指标的隶属函数值，将各项指标的隶属函数值累加，取其平均值。结果(表4)表明，T3处理的隶属函数值最大，T2处理次之，CK处理最差，表明Ca2+、P浓度分别为50、10 mg·kg-1处理下多花黑麦草的生长情况最好，Ca2+、P浓度都为25 mg·kg-1时，次之。

表4 不同钙磷处理对多花黑麦草影响的隶属函数综合评价Table 4 Comprehensive evaluation of membership function of different treatments in L. multiflorum

3 讨论

植株的高低是植物对逆境最直接的反映，叶片是植物光合作用和蒸腾作用的主要器官，叶宽作为叶形指标，在植物逆境适应机制中有着一定的研究意义。本研究结果表明，Ca2+和P浓度都为25 mg·kg-1(Ca/P比为1∶1)时，多花黑麦草的株高和叶宽达到最大值。Ca2+浓度为25 mg·kg-1时，P浓度低于和高于25 mg·kg-1，株高和叶宽均呈现下降趋势。这与前人对蚕豆(Viciafaba)[17]、向日葵(Helianthusannuus)、玉米(Zeamays)和小麦(Triticumaestivum)[18]的研究结果一致，表明适宜的Ca2+和P离子浓度对多花黑麦草生长有促进作用，浓度过高或过低都会抑制其生长。

逆境胁迫下植物体内活性氧和过氧化物的积累会破坏叶绿素，导致其分解并抑制其合成。叶绿素含量直接影响光合作用的进行，在一定范围内与光合速率呈正相关，能在一定程度上反映植物的光合能力[19]，而类胡萝卜素含量的高低与植物耗散过量的激发光能有关。本研究发现，Ca2+浓度处于低水平(25 mg·kg-1)时，随P浓度增加，叶绿素和类胡萝卜素含量增加，而当Ca2+浓度为高水平(50 mg·kg-1)时，随P浓度增加，光合色素含量先增加后降低，表明较高或较低的Ca2+、P会抑制光合色素的合成或加速光合色素的降解，本研究结果与Sabir等[20]对印度人参苗的研究结果相似。造成叶绿素含量降低可能是由于逆境胁迫打破离子平衡限制了铁离子向原卟啉分子的运输，类胡萝卜素含量下降，也不利于植株耗散过量的激发光能，使光合器官的抗强光破坏能力降低[21]。

MDA作为膜脂过氧化产物，其含量的多少直接反映植物细胞发生膜质过氧化的程度。本研究中，CK的MDA含量最高，表明Ca2+、P的缺乏会导致多花黑麦草产生MDA，随着Ca2+、P浓度的添加多花黑麦草细胞的膜质过氧化程度改善，但是当Ca2+、P浓度超过植物生长必需时，又会伤害植物细胞，高Ca、低P伤害效应叠加，加重多花黑麦草受损程度，表现为更多的MDA积累。抗氧化酶用于清除逆境胁迫诱导产生的过多活性氧自由基，保护细胞免受氧化性损伤，增强植物对逆境胁迫环境的适应[22-23]。本研究中，T5和对照(CK)的SOD活性较强，表明这两个Ca2+、P浓度处理，诱导植物建立防御体系，从而避免或缓解了活性氧对植物的伤害；但是T6处理的SOD的活性又较弱，可能是较高的Ca2+浓度直接损害植物细胞引起的。 Pro是水溶性最大的氨基酸，可降低细胞水势，防止胁迫造成的过度失水，在植物的渗透调节中起重要作用[24]。与CK相比，各处理的Pro含量均显著升高，T2处理最高。渗透调节物质能够缓解由于高浓度或低浓度Ca2+、P胁迫造成的细胞失水。

综上所述，适宜的Ca/P比和Ca2+、P浓度可在一定程度上促进多花黑麦草株高和叶宽的提高。Ca2+、P胁迫条件下多花黑麦草可通过提高幼苗的渗透调节物质含量、增强酶活性的策略来适应逆境环境。隶属函数法分析表明，Ca2+、P浓度分别为50、10 mg·kg-1处理最适合多花黑麦草的生长，Ca2+、P浓度都为25 mg·kg-1时，次之。可见，多花黑麦草对低磷有一定的耐受性，因此在喀斯特地区种植多花黑麦草时施入少量磷肥即可满足其生长需要。为避免磷过量造成的资源浪费和水体污染，建议施磷量范围为10～25 mg·kg-1。