斯钙素1表达与肾细胞癌临床预后的关系

苏世强 刘丽哲 陈延 杨翠霞 刘洪久 郭勇 张晋 李珅 庞书舰

1石家庄市第一医院泌尿外科（石家庄050011）；2河北医科大学医学与健康研究院（石家庄050017）

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）简称肾癌，约占肾恶性肿瘤的85%左右，是泌尿系统发病率第2位的肿瘤。约30%～50%肾细胞癌早期缺乏临床表现，多数为体检或其他疾病就诊检查时被发现，约30%肾肿瘤患者确诊时已发生远处转移，其生存情况较差［1］。因此，进一步研究肾细胞癌发生和进展的病理生理过程中的潜在的分子机制，将可能为诊治肾细胞癌提供新的肿瘤标记物和治疗靶点。近年来，研究者发现了一种肿瘤标志物—斯钙素（stanniocalcin，STC）。通过序列同源性研究在哺乳动物中发现了STC，包括2种基因，即 STC1 和 STC2［2］。研究发现 STC1 在多种肿瘤中表达水平上调，如肝细胞癌［3-4］、胃癌［5］、卵巢癌［6］和乳腺癌［7］等。STC2表达异常亦与多种类型的肿瘤相关，MEYER等［8］研究发现STC2可以用来预测肾癌的侵袭性和患者的总体生存情况。然而STC1在肾癌患者中的预后作用尚缺乏相关报道。因此，本研究检测STC1在肾细胞癌中的表达水平，探讨肾细胞癌中STC1的表达水平与肾细胞癌临床预后的关系。

1 资料与方法

1.1 病例选择 选取2011年1月至2012年12月在石家庄市第一医院接受手术治疗的肾细胞癌患者，且同时满足以下标准：（1）病理确诊为肾细胞癌；（2）既往无其他肿瘤史和抗肿瘤治疗史；（3）无围手术期死亡；（4）签署知情同意书，临床病理资料、组织标本及随访数据完整。最后本研究纳入103例符合入组标准的患者。本研究通过石家庄市第一医院伦理委员会审批。

1.2 资料收集 收集并记录患者的临床病理相关资料，包括年龄、性别、术前症状、肿瘤位置、TNM分期、组织类型、肿瘤坏死。患者伴发热、体质量减轻、疼痛、血尿及腹部包块被认为有症状。依据2017版肾细胞癌TNM分期和2004版WHO肾细胞癌病理组织学分类。淋巴结转移情况根据术后病理报告确定，远处转移情况根据影像学资料确定。肿瘤坏死定义为显微镜下凝固性坏死。

所有患者术后规律复查，前两年每3～6个月复查，之后每年复查。复查内容包括体格检查、实验室检查（血常规、肝肾功能等）、腹部超声或者CT以及肺部影像学检查。术后规律随访每例患者，每3个月询问生存情况并记录，中位随访时间为50.4个月。肿瘤学结果采用总体生存评价，具体定义为从手术日期到因各种原因发生死亡的日期之间的时间。

1.3 实时定量PCR 所有103例患者均检测肿瘤组织和瘤旁组织中STC1的mRNA表达水平。肿瘤和癌旁组织在手术切除后先保存液氮中，后冻存于-80℃冰箱中备用。用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）提取组织的总RNA，按照说明书，经一步RT-PCR试剂盒（全式金，北京）逆转录到cDNA上。应用SYBRGreen染料法进行实时定量PCR（ABI 7500，美国应用生物系统公司）。笔者选用PPIA基因作为内参，每个实验样品设置3个以上的重复操作。最后使用2-ΔΔCT相对定量的方法衡量比较各个组间目的基因表达程度区别［9］。STC1的引物序列为正向：5′-AGCAGAATGACTCTGTGAGCCC-3′；反向：5′-CGACCTGTAGAGCACTGTTGAGG-3′。内参PPIA的引物序列为5′-ATGGTCAACCCCACCGTGT-3′；反向：5′-TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC-3′。反应体系为：SYBR Green（2×）10 μL，正向引物 0.25 μmol/L，反向引物 0.25 μmol/L，cDNA模板 1 μL，无核酸蒸馏水至 20 μL。反应条件：94 ℃ 1 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。

1.4 免疫组织化学 全部组织标本先固定，然后行石蜡包埋，肾癌肿瘤标本以及相应的瘤旁正常组织均行连续组织切片（4 μm厚）。按照免疫染色标准流程操作，使用多克隆羊抗人STC1一抗（1∶100，Santa Cruz）；设置阴性对照组，按同样的流程操作，一抗用羊血清替换。具体操作步骤如下：切片脱蜡、水化、高温煮沸法行抗原修复后，用新配制的3%的过氧化氢酶阻断剂封闭，兔血清封闭30 min，每张切片组织上滴一抗后4℃冰箱过夜，第2天取出后室温复温30 min，每张切片组织上滴加羊二抗，37℃孵育30 min，二氨基联苯胺（DAB）显色，蒸馏水终止染色，滴加苏木精复染，干燥后中性树胶封固。标准染色之后的切片由二位病理医师独立双盲地进行评价分析。根据以往研究的标准［9］，每个标本至少评价5个高倍镜视野，每个高倍镜视野分析200个细胞，如果标本中多于10%的细胞胞质被染色则为阳性，反之为阴性。

1.5 统计学方法 肿瘤组织和瘤旁组织中STC1的mRNA和蛋白比较分别采用t检验和秩和检验；所有分类数据用百分比表示。对于分类数据的组间比较，采用卡方检验。所有患者按STC1表达水平的中位数分为低表达组和高表达组。为了研究STC1在肾细胞癌中的预后作用，首先采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线并用log-rank比较两组间的差异，然后采用Cox回归的方法进行验证。Cox回归分析中纳入临床相关变量和STC1的表达水平，单因素分析中P＜0.05的变量进一步纳入多因素分析。所有统计分析用R软件（3.5.3版本）完成，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 STC1在肾细胞癌中的表达 所有103例患者均检测肿瘤组织和瘤旁组织中STC1的mRNA表达水平。结果表明与瘤旁正常组织相比，STC1的mRNA表达水平在肿瘤组织中明显上调（P＜0.001，图1）。同时，30例患者检测了肿瘤组织和瘤旁组织中STC1的蛋白表达水平。免疫组织化学染色结果表明STC1蛋白主要定位于肾癌组织和正常肾组织细胞的胞质中（图2）。与mRNA表达水平结果一致，STC1的蛋白表达水平在肿瘤组织中明显高于瘤旁正常组织（P＜0.001，图3）。

2.2 STC1表达水平与肾细胞癌患者临床病理变量的关系 患者的临床病理相关资料见表1。大部分患者为透明细胞癌，占所有患者的70.9%，31（30.1%）例患者肿瘤中发生坏死。研究STC1的表达水平与临床病理相关变量的关系，发现STC1高表达组患者中更多患者发现疾病时伴发症状（P＜0.001），T3和T4的患者比例更高（P＜0.001），淋巴结转移的比例更高（P=0.047），远处转移发生的比例更高（P=0.016），肿瘤坏死的比例更高（P＜0.001）。STC1的表达水平与年龄、性别、肿瘤位置以及组织类型无明显关联（P＞0.05）。

图1 肾细胞癌肿瘤组织和瘤旁组织中STC1的mRNA表达水平Fig.1 Expression level of STC1 mRNA in adjacent non-tumor tissues and renal cellcarcinoma tissues

2.3 STC1的表达水平与肾癌临床预后的关系 对于所有103例患者，中位随访时间为50.4个月，随访期内32例患者因各种原因发生死亡。按STC1表达水平的中位数分为低表达组和高表达组。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，STC1高表达组患者总体生存明显差于低表达组患者（P＜0.001，图4）。单因素分析发现症状（P＜0.001）、T分期（P＜0.001）、淋巴结转移（P=0.008）、远处转移（P＜0.001）、组织类型（P=0.048）、肿瘤坏死（P＜0.001）和STC1表达水平（P＜0.001）与患者总体生存明显相关。多因素分析发现只有远处转移（P=0.009）、组织类型（P=0.013）和肿瘤坏死（P=0.017）是肾细胞癌术后总体生存的独立预测因素，而包括STC1表达水平在内的其他变量不能作为独立的预后因素（P＞0.05，表2）。

图2 免疫组织化学染色结果（×400）Fig.2 Immunohistochemical staining of STC1（× 400）

图3 肾细胞癌肿瘤组织和瘤旁组织中STC1的蛋白表达水平Fig.3 Protein expression level of STC1 in adjacent non-tumor tissues and renal cell carcinoma tissues

3 讨论

图4 STC1低表达和高表达组患者术后总体生存曲线Fig.4 Overall survival curve of patients with STC1 low expression and high expression in renal cell carcinoma

肾细胞癌是泌尿系统最致命的恶性肿瘤之一，目前肾细胞癌诊治中的难点主要表现为发现晚、发现后难以根治以及根治后转移复发等一系列问题，文献报道近30%患者在首次就诊时肿瘤已经发生远处转移，而且仍有部分肾细胞癌患者术后出现复发，导致其生存情况较差［1］。目前为止，临床尚无有效的肿瘤标记物提高肾细胞癌早期诊断的准确率。所以寻找一个能够准确预测肾细胞癌预后的肿瘤标记物，借以来帮助指导临床治疗决策尤为重要，以便能够发现那些更可能发生术后复发以及远处转移的患者，采用更加积极的治疗方式和更早的靶向治疗或许能使他们获益［10］。

表1 STC1表达水平与肾细胞癌患者临床病理变量的关系Tab.1 Relationship between expression level of STC1 and clinicopathological variables in patients with renal cell carcinoma 例（%）

STC为一种糖蛋白性质的激素，参与调节维持机体内钙磷的平衡稳态。哺乳动物STC1在各种组织中广泛表达，在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等方面起重要作用。研究证实STC1参与调节钙磷的平衡稳态，而且它能够通过抑制活性氧簇的生成来发挥保护细胞和抗炎的作用，越来越多的证据表明STC1可能在多种肿瘤形成以及进展中发挥重要作用［2］，一系列的研究发现STC1与肿瘤的进展和转移有关［4，6，11-12］，这些研究结果促使笔者去研究STC1在肾细胞癌中的表达和预后关系。

表2 肾癌患者总体生存预测因素分析Tab.2 The Cox regression model was applied to identify the prognosis factors for overall survival of renal cell carcinoma

目前，STC1在肾癌中的功能和机制研究报道较少。杨清滔等［13］发现STC1通过调节缺氧诱导因子1α和钙离子水平来调控肾癌细胞的增殖。MA等［14］发现STC1的mRNA以及蛋白质的表达水平在肿瘤标本中显著上调，进一步机制研究发现敲低STC1可以抑制肾癌细胞生长、迁徙和浸润侵袭，STC1可能通过促进上皮间皮变使肾细胞癌发现远处转移。曾金敏等［15］研究发现肾细胞癌患者外周血STC1基因表达阳性，进而通过肾癌细胞实验发现不同浓度STC1影响肾癌细胞的增殖与凋亡。本研究纳入103例肾细胞癌患者，采用实时定量PCR和免疫组化的方法检测肾细胞癌组织和瘤旁组织中STC1的mRNA和蛋白质的表达水平。结果显示肾细胞癌组织中STC1的mRNA和蛋白质的表达水平明显高于瘤旁组织，既往文献报道STC1在各种肿瘤中表达水平上调，这些包括结直肠癌［16］、肝细胞癌［3-4］、胃癌［5］、卵巢癌［17-19］、乳腺癌［7］和前列腺癌［20］，本研究结果与既往报道相一致。

本研究通过检测STC1在肾细胞癌肿瘤组织和瘤旁正常组织中的表达水平，探讨肾细胞癌中STC1的表达水平与肾细胞癌临床预后的关系。发现STC1高表达组患者中更多患者发现疾病时伴发症状，T3和T4的患者所占比例更高，淋巴结转移的比例更高，远处转移发生的比例更高，肿瘤坏死的比例更高。虽然STC1低表达组患者术后总体生存明显优于高表达组患者。但是单因素和多因素的Cox回归分析发现只有远处转移、组织类型和肿瘤坏死是肾细胞癌术后总体生存的独立预测因素，STC1的表达水平不能独立地预测患者的总体生存。关于STC1与肾细胞癌临床病理变量的关系，MA等［14］也发现发现STC1的mRNA表达水平和肾癌组织的Fuhrman分级和临床分期明显相关。既往也有较多文献报道了STC1在其他肿瘤中的预后作用，CHAN等［3］发现血清中高表达的STC1与肝细胞癌更大的肿瘤直径和更差的5年无病生存相关。BRANTLEY等［21］发现原发肿瘤中STC1的表达水平与乳腺癌晚期复发有着较强的关联，STC1的表达水平越高，乳腺癌晚期复发概率越高。本研究通过分析STC1表达水平与肾细胞癌患者预后的相关性，发现STC1表达水平与高T分期、淋巴结转移、远处转移、肿瘤坏死等预后不良因素明显相关，而且STC1表达水平越高，肾细胞癌患者总体生存越差。但是可能由于病例样本量不足以及随访时间有限，STC1表达水平不能作为肾癌预后的独立预测因子。

综上所述，STC1在肾细胞癌中表达上调，STC1表达水平与肾细胞癌总体生存呈负相关，然而本研究表明STC1表达水平不能作为肾细胞癌患者独立的预后因子。