针刺对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠磷酸化P38丝裂原活化蛋白酶的影响

宋方亚，辛祺亮，赵东杰，李 琪，王玉华，董 莎，辛随成＊

（1. 北京中医药大学针灸推拿学院 北京 100029；2. 北京中医药大学东方学院 廊坊 065001）

多发性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一种自身免疫性疾病，其主要病理特征为中枢神经系统炎性脱髓鞘，主要累及白质区域，其发病可能与免疫反应、病毒感染、环境及遗传等多种因素有关，世界范围内大约有250 万MS 患者[1]，患者可见感觉异常、肢体瘫痪、视力减退及共济失调等症状，具有较高的发病率和致残率。急性发作期MS 常用大量甲泼尼龙进行冲击治疗，复发型MS 常用干扰素或其他免疫抑制剂控制疾病发展。针刺可改善MS 神经功能损伤，降低MS 复发率，提高MS 患者生活质量，可作为MS 的补充治疗手段[2]。

p38MAPK 信号通路参与调节细胞生长、分化和凋亡，也参与炎症反应的过程。研究发现，p38MAPK 对CD4+T 细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞均有调节作用，影响炎性因子的产生以及神经细胞修复过程，进而参与MS 的发病过程[3-4]。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）与MS 具有相似的临床症状与生理病理变化，目前通常通过干预EAE 模型对MS 进行研究。本实验通过观察针刺针刺对EAE 小鼠体重及神经功能损伤的影响，对EAE 小鼠脑干内p-p38MAPK 含量的影响，验证针刺对EAE 小鼠的治疗作用，探究针刺治疗MS 的作用途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8 周龄雌性C57BL/6 小鼠40 只，体重18～20 g，购于北京维通利华实验动物有限公司，动物批号SCXK（京）20160006。饲养于北京中医药大学SPF 级动物房，室温20℃～24℃，相对湿度30%～50%，12 小时周期明暗交替。适应性喂养1周。

1.2 主要试剂

MOG35－55 多肽（北京百诺威生物有限公司，批号NJP30376），完全弗氏佐剂（结核杆菌H37Ra 终浓度为4 mg/mL 北京华菁科技有限公司，批号170597），百日咳毒素（北京百诺威生物有限公司，批号181236A1），5 mg/片醋酸泼尼松（上海上药信谊药厂有限公司，批号017171002），0.25 mm × 25 mm 针灸针（北京中研太和医疗器械有限公司），磷酸化p38MAPK抗体（英国abcam公司，批号ab47363）。

1.3 动物分组

将40 只C57BL/6 小鼠称重编号，用随机数字表分成空白组、模型组、针刺组、激素组，每组10 只。空白组小鼠不做处理，其余组小鼠均制备成EAE小鼠。

1.4 动物模型制备

将抗原MOG35－55 用生理盐水稀释至浓度为10 mg/mL，并与完全弗氏佐剂按等体积混合，用注射器反复推拉，混合均匀，制备成油包水的乳剂，制成完全抗原。取模型组、针刺组、激素组小鼠，先将小鼠进行乙醚麻醉及充分固定，每只小鼠脊柱两侧分4 点皮下注射0.1 mL 抗原。在注射抗原后即刻以及注射抗原后第48小时，每只小鼠分别予500 ng百日咳毒素进行皮下注射，制备EAE 小鼠。空白组注射等体积生理盐水。

1.5 模型评价

造模及干预过程中各组小鼠无死亡。免疫后各组小鼠均出现体重减轻、食欲减退、精神萎靡、动作笨拙，发病率为100%（30/30）。

每日记录神经功能评分，参考国际通用的5 分评分制[5]：0分：无症状；1分：尾张力消失，轻度步态笨拙；2 分：一侧后肢无力，被动翻身后恢复；3 分：双后肢瘫痪，刺激后可挪动；4 分：双后肢瘫痪伴有前肢瘫痪；5分：濒死状态或死亡。其中，症状在两者之间者，以±0.5分计算。隔日测量记录小鼠体重。

图1 各组小鼠免疫第0天至第28天体重变化

1.6 干预方法

造模后第14 天起，各组连续干预15 天。空白组和模型组每天进行抓取、固定，给予0.1 mL/10 g 生理盐水灌胃。针刺组使用0.25× 25 mm 毫针，针刺小鼠“大椎”（背部正中第7 颈椎与第1 胸椎之间），直刺2～3 mm；双侧“肾俞”（第2 腰椎下两旁），向脊柱斜刺2～3 mm；双侧“足三里”（膝关节下外侧腓骨小头下3.5 mm），直刺2～3 mm，每次留针15min。激素组进行醋酸泼尼松药液（0.6 mg/mL，）灌胃，0.1 mL/10 g/天。

1.7 检测指标

免疫后第28 天，每组随机选取3只小鼠，多聚甲醛缓冲液进行心脏灌注，沿大脑冠状面在视交叉水平向后取3～4 mm 组织块，制备石蜡切片，进行LFB 髓鞘染色，每只小鼠取3张切片进行p-p38MAPK 免疫组化检测。剩余7 只小鼠处死后取脑干组织，进行pp38MAPK的WB检测。

1.8 统计方法

采用sas 8.2 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较方差齐采用LSD 检验，方差不齐时用Welch检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 各组小鼠体重比较

本次实验共40 只小鼠，实验过程中无小鼠死亡，且30 只小鼠全部造模成功。由图1 可以看出，空白组小鼠免疫第0 天（即模型制备当天）至免疫第28 天体重持续增加。模型组、针刺组、激素组小鼠免疫第0天至第12天左右体重持续增加，且与空白组变化趋势相似；免疫第12 天至第24 天，三组小鼠体重均下降，模型组小鼠体重下降最明显，针刺组次之，激素组体重下降最少；免疫第24 天至第28 天，三组小鼠体重逐渐增加，但在实验结束时并未超过各组第12天时的体重最高值。

表1 各组小鼠平均体重比较（±s，g）

表1 各组小鼠平均体重比较（±s，g）

注：与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与激素组相比，cP<0.05

28 d 21.79±0.47 18.30±0.44a 19.11±0.46abc 19.51±0.42ab组别空白组模型组针刺组激素组n 10 10 10 10 0 d 19.44±0.47 19.39±0.47 19.59±0.51 19.32±0.51 4 d 19.72±0.43 19.43±0.51 19.32±0.51 19.32±0.47 10 d 20.39±0.37 20.00±0.44a 19.98±0.37a 20.01±0.45a 16 d 21.09±0.43 19.74±0.41a 19.99±0.36a 20.10±0.44a 22 d 21.56±0.41 18.10±0.30a 19.01±0.40abc 19.64±0.41ab

表2 各组小鼠神经功能评分比较（±s）

表2 各组小鼠神经功能评分比较（±s）

注：与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05；与激素组相比，cP<0.05

28 d 0 2.45±0.50a 1.80±0.42abc 1.35±0.34ab空白组模型组针刺组激素组10 10 10 10 0 d 4 d 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.25±0.26a 0.20±0.26a 0.15±0.24a 0 2.30±0.26a 1.95±0.37ab 1.90±0.39ab 0 3.20±0.35a 2.65±0.34abc 2.15±0.24ab组别n d 16 d 22 d

图2 各组小鼠免疫第0天至第28天神经功能评分变化

由表1 可以看出，实验开始时四组小鼠体重无差异（P>0.05）；免疫第10天，空白组小鼠体重大于模型组、针刺组、激素组（P < 0.05），模型组、针刺组、激素组三组小鼠体重无差别（P>0.05）；免疫第22天以后，模型组小鼠体重小于针刺组、激素组（P<0.05），且激素组小鼠体重大于针刺组（P<0.05）。

2.2 各组小鼠神经功能评分比较

模型组、针刺组、激素组小鼠逐渐出现精神萎靡、尾张力减弱、肢体活动不利甚至瘫痪等症状。由图2可以看出，空白组小鼠由于未造模，神经功能无损伤，整个实验过程中神经功能评分为0；免疫第0 天至第10 天模型组、针刺组、激素组小鼠未出现神经功能损伤症状，评分为0；免疫第10天后模型组、针刺组、激素组小鼠开始出现神经功能损伤症状，神经功能评分开始持续升高；免疫第20 天，激素组小鼠的评分开始持续下降；免疫第22 天，模型组和针刺组小鼠评分开始持续下降；免疫第28天实验结束时模型组、针刺组、激素组小鼠评分较各组最高峰时评分均下降，但并未降至0。

由表2 可以看出，免疫第10 天，模型组、针刺组、激素组的神经功能评分无差异（P > 0.05）；免疫第16天，针刺组和激素组神经功能评分低于模型组（P <0.05），针刺组和激素组神经功能评分未出现差异（P>0.05）；免疫第22 天以后，针刺组神经功能评分高于激素组（P<0.05）。

2.3 各组小鼠LFB髓鞘染色结果

空白组脑组织形态正常，髓鞘致密，排列整齐，无空泡样改变，未见脱髓鞘。模型组髓鞘排列不整齐，有大片脱髓鞘区域，空泡样改变明显，针刺组和激素组可见髓鞘排列不整齐，部分区域可见脱髓鞘及空泡样改变，脱髓鞘情况较模型组轻，空泡样改变较模型组少，见图3。

2.4 各组小鼠脑组织p-p38MAPK免疫组化表达

空白组小鼠脑组织p-p38MAPK 水平较其他三组低（P < 0.05）。针刺组、激素组小鼠脑组织pp38MAPK 水平较模型组低（P<0.05）。针刺组小鼠脑组织p-p38MAPK 水平与激素组差异不明显（P >0.05）。见表3。

p-p38MAPK 主要存在于EAE 小鼠脑组织胞浆内，免疫组化阳性表达为黄色或棕黄色颗粒。空白组小鼠脑细胞形态规则，染色为多为蓝色，胞浆内可见少量黄色颗粒。模型组小鼠脑细胞体积增大，形态不规则，胞浆呈深黄褐色。针刺组及激素组小鼠脑细胞形态较规则，胞浆染色程度较空白组深，较模型组浅。见图4。

图3 各组小鼠脑组织LFB染色病理片（LFB×400）

表3 各组小鼠脑组织免疫组化p-p38MAPK平均积分光密度IOD值（±s）

表3 各组小鼠脑组织免疫组化p-p38MAPK平均积分光密度IOD值（±s）

注：与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05

p-p38MAPK平均IOD值（10-3）5.48±1.62 14.81±2.43a 11.88±2.74ab 10.71±2.86ab组别空白组模型组针刺组激素组n 3 3 3 3

2.5 各组小鼠脑组织p-p38MAPK蛋白WB检测

空白组小鼠脑组织p-p38MAPK 水平较其他三组低（P < 0.05）。针刺组、激素组小鼠脑组织pp38MAPK 蛋白水平较模型组低（P<0.05）。针刺组小鼠脑组织p-p38MAPK 蛋白水平与激素组差异不明显（P>0.05）。见表4、图5。

3 讨论

MS 是发生在中枢神经系统（central nervous system，CNS）由自身免疫反应介导的神经脱髄鞘疾病。病理表现为CNS 内散在的多区域白质髓鞘脱失，最常累及脑室周围白质、视神经、脊髓、脑干等部位的神经元细胞及其轴索。由于损伤部位不同，MS 患者临床症状表现多样，可见多种运动障碍、感觉异常、共济失调等[6-8]。临床可分为原发进展型（PPMS）、继发进展型（SPMS）、进展复发型（PRMS）和复发缓解型（RRMS）四种类型。其病因病机不明确，目前临床以激素治疗为主，激素疗效不理想时可考虑使用血浆置换、静脉注射免疫球蛋白等方法[9-10]。

表4 各组小鼠脑组织p-p38MAPK蛋白表达水平比较（±s）

表4 各组小鼠脑组织p-p38MAPK蛋白表达水平比较（±s）

注：与空白组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05

p-p38MAPK蛋白表达水平0.27±0.07 0.68±0.24a 0.42±0.19ab 0.40±0.14ab组别空白组模型组针刺组激素组n 7 7 7 7

p38MAPK 是大多数细胞内的一类重要信号转导酶，活化后的p38主要以p-p38MAPK 的形式存在。细胞内存在MKK3、MKK6等活化p38MAPK的上游激酶，以及T 细胞受体,可激活p38MAPK，使其自身磷酸化。研究发现，使用p38MAPK 抑制剂SB203580 可抑制EAE 小鼠p38MAPK 磷酸化，降低EAE 小鼠的发病率、体重损失及神经功能损伤程度[11-13]。用蜂毒针干预EAE 大鼠“足三里”穴，发现炎细胞数量及炎性因子表达均减少，p-p38MAPK 的表达也减少[14]。抑制小胶质细胞内p38MAPK 通路，可减少炎性因子的产生，抑制EAE 的炎症反应[15]。由此可见，p38MAPK 信号通路在MS的发病中起着重要的作用。

图4 各组小鼠脑组织p-p38MAPK免疫组化病理片（×400）

图5 各组小鼠脑组织p-p38MAPK蛋白表达电泳条带图

中医无“多发性硬化”病名，根据症状可诊断为“青盲”“风痱”“痿证”“痹症”，现多以“痿证”命名[16]。其病因包括外感和内伤两大类。外感温热邪毒、饮食劳倦、先天不足、内伤情志、跌扑损伤等均可消耗人体气血，疾病长期迁延致使脏腑受损，肌肉筋脉失去滋养，最终导致“痿证”。其病变部位在肌肉筋脉，但根本原因在于脏腑受损，气血精津亏损。《临证医案指南》认为“痿证”为“肝肾肺胃四经之病”。“肝肾”为先天之本，“肺胃”为后天之养，治疗MS 多以此入手。实验选取“大椎”穴为“阳脉之海”督脉上的要穴，是手足阳经的交会穴，统领一身阳气，既可以在MS 发病之初发散郁热，又可以在恢复期促进气血运行。“肾俞”为肾的背俞穴，肾藏精，主骨生髓，肾精不足则筋骨失养，可见运动障碍，肾司二便，肾气失司则见二便失调，“肾俞”穴可培补先天肾气，濡养筋骨。“足三里”为阳明经之合穴，胃之下合穴，胃是气血之海，气血生化之源，为生命活动提供能量，同时脾胃主四肢肌肉，《素问·痿论》提出“治痿独取阳明”的原则，“足三里”既能促进气血的生成，又能条畅人体气机。

目前，MS 以激素治疗为主，但激素治疗也带来失眠、焦虑、高血压、高血糖、胃肠功能紊乱、骨质疏松等副作用[17]。针刺作为一种替代疗法，能够改善神经功能残疾、疼痛，改善疲劳状态，提高患者生活质量[18]。Fatemeh Shadman针刺太溪、水道、复溜、血海、关元、气海、曲骨、中极、肓俞、命门、水分、肾俞等穴位，结果显示针刺组前列腺症状评分（I-PSS）和尿路症状导致的生活质量评分（QOLU）均低于非针刺组[19]。王春琛等[20]通过金针王乐亭经验方“老十针”“督脉十三针”“手足十二针”及随症加减穴位针刺治疗，可使缓解期的复发缓解型MS 患者神经功能缺损症状减轻，降低年复发率。目前，关于研究p38MAPK 在MS 发病过程中的作用，以药物治疗为主，针刺干预较为少见。实验研究发现针刺可以干预多种疾病的p38MAPK 转导通路，如针刺“百会”透“曲鬓”可以降低脑内p38MAPK的表达，对大鼠脑出血后继发性脑损伤的神经细胞凋亡有抑制作用，起到了脑保护作用[21-22]。心肌缺血再灌注模型大鼠p38MAPK 表达上调，电针“内关”可以明显抑制p38MAPK 的蛋白表达，发挥其抗心肌缺血的作用[23]。因此，推测针刺可能通过对p38MAPK 转导通路的调节，作用于EAE。

本实验研究结果显示，EAE 小鼠在模型制备后体重先持续增长，在制备模型后第12 天开始，随着小鼠中枢神经脱髓鞘程度的增加，小鼠各项生理功能出现障碍，体重开始下降，针刺组体重较模型组重，表明针刺可减少EAE 小鼠的体重损失。神经功能评分是小鼠神经功能损伤的量化，针刺组小鼠神经功能评分较模型组低，表明针刺可减轻EAE 小鼠的神经损伤程度。LFB 髓鞘染色可观察髓鞘脱失的程度，电镜下可观察到针刺组小鼠的神经细胞排列较模型组致密，髓鞘脱失程度低，表明针刺可改善EAE 小鼠中枢神经系统的髓鞘脱失。免疫组化结果显示在EAE 小鼠中枢神经细胞胞浆内有大量p-p38MAPK 表达，WB 检测显示各组小鼠的体重损失、神经功能评分以及髓鞘脱失情况与中枢神经细胞内p-p38MAPK 含量有关，针刺组p-p38MAPK 表达较模型组低，表明针刺可影响EAE小鼠的中枢神经细胞中p-p38MAPK的表达。

综上所述，本研究通过针刺干预EAE 小鼠，验证针刺可以改善EAE小鼠体重损失，降低EAE小鼠神经功能损伤程度，改善EAE 小鼠中枢神经系统的髓鞘脱失，其作用机制可能是抑制脑内p38MAPK 的蛋白表达，但具体作用通路还有待于进一步研究。