HPLC-MS/MS法鉴定黄连碱在糖尿病大鼠尿液、粪便、胆汁中的代谢产物＊

戚 婧，陈红影，刘起华，郑 伟，李志慧，陈建华，黄运芳，张 婷，魏桂杰，张玉杰＊＊，马鹏凯＊＊

（1. 北京中医药大学中药学院 北京 102844；2. 中国中医科学院广安门医院 北京 10053）

糖尿病被中医称作“消渴”，是一种以糖代谢异常为主要特点的代谢疾病群，严重威胁人类健康和寿命的常见慢性疾病。糖尿病及其并发症是临床常见病、多发病。对糖尿病的用药治疗上有着非常悠久的历史，并积累了诸多的经验。如中医古籍《名医别录》《后肘备急方》《本草纲目》等均有黄连“止消渴”的详细方药记载[1]。

现代研究表明，黄连的主要药效成分为生物碱，包括小檗碱、巴马汀、防己碱、小檗红碱、药根碱、黄连碱（Coptisine，COP），均具有确切的抗炎、降血糖、降血脂、抗老年痴呆等广泛的药理学作用[2]。其中，COP 是一种天然的原小檗碱类生物碱，主要存在于毛茛科和罂粟科的多种植物中，资源丰富且药理作用广泛，是除小檗碱之外，含量较高的原小檗碱类生物碱之一，有利于血液中的葡萄糖向细胞内部转运，进而降低血糖浓度，这说明在治疗糖尿病方面COP 有潜在的药效[3]。COP 与小檗碱有相同的母体结构，两者结构差异小，生物活性较高。COP 作用主要包括抑制A 型单胺氧化酶、选择性抑制和双重抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制破骨细胞分化的功能、选择性调节血管平滑肌细胞中的多药耐药蛋白质等[4-8]。越来越多的研究结果表明，COP具有重要的开发利用价值。

关于药物体内的代谢研究，不仅是药性评价的重要组成部分，更是影响药物作用的最重要的因素之一。不仅对于化合物的体内处置过程研究有重要意义，对先导化合物的结构优化以及其毒性或反应性代谢物的体内清除过程同样起到关键作用。药物在体内发挥药理活性后大多排出体外，在这个过程中，代谢酶、药物性质、药物剂量以及病理状态等都对药物在体内的代谢过程有重要影响。因此，对于全面了解化合物在体内的代谢过程，做进一步研究药物如何在病理状态下发挥作用具有十分重要的意义[7]。

数十年的临床研究表明，糖尿病患者服用黄连可以有效控制其血糖水平，推测是由于黄连中有效成分能够降低胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性，降低胰高血糖素，且患者长期服用无明显毒副作用，相较于传统西药治疗，中药治疗疗效显著，但其具体作用机制有待进一步探究。同时，病理状态可能会使转运体功能发生明显的改变，这种改变会使药物体内药动学过程受到显著的影响，严重时会导致疗效增强或产生药物毒副作用[9]。因此，研究药物在病理状态下的代谢产物和代谢途径对于阐明药物药理机制、明确药物发挥活性的物质基础、指导临床合理用药等方面具有重要意义[10]。通过对COP 药动学研究发现，与正常大鼠相比较，黄连碱在糖尿病模型大鼠体内的生物利用度显著提高[8]，推测其在糖尿病状态下的代谢行为可能发生了改变，故有必要对其体内代谢过程进行进一步的研究。

目前，对中药的开发研究，主要集中在糖尿病并发症的防控方面，大大限制了中药的临床应用，对于中药降血糖的病理机制以及病理状态下的代谢过程研究并不深入。虽然目前很多文献表明中药对于降糖的作用显著，但临床上中药的降糖应用远不如西药的应用频率，导致临床基础研究优势并不突出[9]。因此，研究药物的代谢产物和代谢途径对于阐明药物药理机制、明确药物发挥活性的物质基础、指导临床合理用药等方面具有重要意义。鉴于此，本研究采用HPLC- MS/MS 技术对糖尿病大鼠模型口服COP 后尿液、粪便、胆汁中药物原型及代谢产物进行鉴定，为更全面的了解COP的体内过程提供依据。

1 试剂与仪器

1.1 试剂

黄连碱（COP，成都曼思特生物技术有限公司，批号MUST-12111602，纯度≥98%）；链脲佐菌素（STZ，美国Sigma-Aldrich 公司，纯度≥98%）；乌拉坦（上海麦克林生化科技有限公司，批号M17818018）；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Thermo Fisher Scientific TSQ Quantum 液质联用仪，配有大气压化学离子源（APCI）和电喷雾离子源（ESI）及Xcalibur 数据系统（赛默飞世尔科技有限公司，美国）；KQ-300B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL20M 型高速冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）MTN-2800D 型氮气吹干仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.3 动物

SPF 级雄性SD 大鼠18 只，体重（200±20）g，购于斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，许可证号：SCXK（京）2011-0004。标准动物房中饲养，室温22℃～25℃，湿度50%～65%，光照条件为12 h 明暗交替，喂以SPF级标准饲料。本研究所涉及的动物实验，均符合北京中医药大学动物伦理委员会标准。

2 方法

2.1 色谱－质谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18(150 mm×4.6 mm，5µm)；采用C18保护柱（10 mm×4.6 mm，5µm）；流动相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脱（0 ～10 min，30%～70%A；10 ～15 min，70% ～80%A；15 ～20 min，80% ～30%A；20 ～30 min，30%A）。柱温：25℃；流速：1 mL/min；进样量：10µL，分流比：4∶1；样品架温度：4℃[11]。

离子源：电喷雾电离（ESI）；检测方式：正离子模式（Positive，Negative）；喷雾电压：3000 V；干燥气温度：350℃；雾化器设置：206.90 kpa；鞘气（N2）流速：10.0 L/min；扫描范围m/z：50 ～700，COP：320 →292；BBR：336 →320。

2.2 动物实验与样品前处理

2.2.1 糖尿病大鼠模型的制备[8]

大鼠适应性饲养3 d后，按40 mg/kg剂量腹腔注射新鲜配置的1%链脲佐菌素溶液，1次/d，连续6 d，大鼠断尾取血，通过血糖仪每日监测空腹血糖值，同时记录体重，血糖值高于16.7 mmol/L，确定为糖尿病造模成功，否则重复以上实验操作，补注链脲佐菌素，重新测血糖，达到要求血糖值并稳定一段时间后用于实验研究。

2.2.2 大鼠给药及体内排泄样品的收集

分别取正常及糖尿病大鼠各3 只，分别置于代谢笼，自由饮食，收集粪便和尿液作为空白样品；给药前禁食12 h，自由饮水。大鼠称重后，按照20 mg/kg剂量口服灌胃给予COP 药物溶液（精密称取COP 适量，加入0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液适量，研匀后加入生理盐水适量，超声3 min，配成2 g/L 的药物溶液），之后置于代谢笼，自由饮食，分别收集0～48 h 尿液和粪便样品。样品置于-80℃保存。

分别随机选取正常及糖尿病大鼠各3只，禁食12 h，自由饮水。灌胃给予生理盐水后，立即采用腹腔注射25%乌拉坦溶液，麻醉后打开大鼠腹腔进行胆管插管，收集0 ～36 h胆汁用作空白胆汁样品。另外，分别随机选取正常及糖尿病大鼠各3 只，禁食12 h，自由饮水。按照20 mg/kg 剂量灌胃给予上述COP 药物溶液后，采用同样的方法对大鼠进行麻醉，胆管插管，收集0 ～36 h胆汁作为待测胆汁样品。样品置于-80℃保存。

2.2.3 样品的处理

分别取空白、给药粪便样品，称重，加入约4 倍量甲醇，捣碎匀浆，超声提取30 min，取匀浆液1 mL，15 000 r/min 离心15 min，取上清液，0.45µm 微孔滤膜过滤，取续滤液用于HPLC-MS/MS分析[12]。

分别取空白和给药尿液和胆汁样品，加2 倍甲醇混匀，超声提取20 min，15 000 r/min 离心15 min，取上清液，0.45 µm 微孔滤膜过滤，取续滤液用于HPLCMS/MS分析。

3 结果

在正离子模式下，对各组处理后的6 个生物样品进行一级全扫描（m/z 范围：50 - 700），对生物样品中的原型及代谢物进行鉴定。由于药物在生物体内的发生代谢转化，主要是药物分子在保留原有基本骨架的基础上，在酶的作用下发生的官能团的改变，或者在酶的作用下发生的结合反应，因此，代谢物具有原药的特征质谱裂解碎片或中性丢失。本次实验在正常和糖尿病大鼠的尿液、粪便、胆汁共发现14 个COP代谢产物，通过HPLC-MS/MS 方法进一步分析，COP在糖尿病大鼠与正常大鼠在尿液、粪便和胆汁代谢产物的种类和数量并无本质的区别，且分别在尿液、粪便和胆汁中鉴定出10个、11个和8个代谢产物。

将给药组样品图谱与空白组样品对比分析，图1为生物样品中检测到的COP 及其代谢物的MS1和MS2质谱图，表1 为COP 代谢物鉴定结果。结合具有相同骨架的生物碱如小檗碱在生物体内的代谢规律和质谱裂解规律[10,13]，分析各代谢产物可能的代谢途径如图2所示。

一般在采用HPLC-MS 进行代谢研究时，要注意不同位点可能发生同一代谢过程，会生成多种具有同分异构体性质的代谢产物，因此不能够只凭质量数的变化进行结构鉴定，还要根据代谢过程的质量变化进行代谢物筛査和鉴定。关键在于裂解途径的分析与鉴定以及通过研究药物原型及其代谢物的裂解过程，比较碎片离子和母离子的差异，将有助于代谢物结构的准确鉴定[14-15]。

COP 各代谢物的结构推断，主要根据药物在体内代谢规律以及已报道的COP 的裂解规律，还有其他原小檗碱型生物碱代谢特点[16]，再通过EIC 离子流图和一级、二级碎片离子信息及色谱保留时间。M0 的m/z为320.09，其子离子m/z 292.03，结合COP 的质谱图推测该化合物为COP原型。

多数药物经过体内生物转化，即发生I相代谢和II相代谢，通过引入某些基团或与内源性物质共价键结合生成亲水性更强的形式，从而达到增加药物亲水性的目的，大部分经尿液排泄排出体外。代谢反应分成两大类：I相反应和II相反应。常见的I相反应包括氧化、还原、水解等，目的是引入或暴露某些极性官能团，如羟基、羧基、氨基和巯基等；II 相反应则通过与内源性物质经共价键结合，生成极性大、水溶性高的结合物[17]。

图1 COP及其代谢物的MS1和MS2质谱图

表1 COP及其代谢产物的[M+]/MS2信息

图2 COP体内的主要代谢途径（Glu：葡萄糖醛酸）

通过糖尿病大鼠体内COP 生物转化分析研究，以COP 为原型共鉴定出了14 个代谢产物。“C-O”键断裂后产生的M3（m/z 336.120）和M5（m/z 352.25）分别比其母离子增加了16 和32，推测是由COP I 相代谢发生羟基化或两次羟基化生成的，M3 再发生葡萄糖醛酸化形成M14（m/z 528.29）。与此类似的变化，还有M9（m/z 340.10）和M11（m/z 356.28），这两个代谢产物可能是M0 发生多次羟基化生成的。COP 原型M0 脱氢后变为M1（m/z 318.30），M1 继续发生葡萄糖醛酸化形成为M12（m/z 482.19），M13（m/z 470.32）分子量比M12少12，推测是M1 发生葡萄糖醛酸化结合反应后去甲基化的产物，M4（m/z 388.27）比M1 的分子量增加了70，是由M1 发生硫酸酯化形成的。代谢物M6（m/z 308.09）比COP 原型减少了12，推测可能是由于形成双键形成的（脱掉次甲基）。COP 原型先加氢还原反应后形成了M2（m/z 322.11），M2 的一部分通过I 相代谢加氢还原形成了M7（m/z 324.29），M2 的另一部分通过发生葡萄糖醛酸化形成了M8（m/z 498.29）。M10（m/z 296.18）是由M0去甲基化后加氢还原所得。代谢产物大部分通过尿液排出体外。COP 的代谢反应类型主要是I相代谢（羟基化、氢化、去甲基化和脱氢）和II相代谢（葡萄糖醛酸结合和硫酸酯化）。推测主要代谢产物见表1，代谢途径见图2。

本实验通过对正常和糖尿病大鼠生物样品尿液、粪便、胆汁中COP 及其代谢物的定性分析得出，COP可在大鼠体内可发生较广泛的Ⅰ相和Ⅱ相代谢，在大鼠尿液、粪便、胆汁共鉴定出14 个代谢产物，尿液10个、粪便11 个、胆汁中8 个。其中Ⅰ相代谢产物5 个，主要为羟基化物和去甲基化物；Ⅱ相代谢产物9个，主要为葡萄糖醛酸化物。

总的来看，COP 的代谢产物在糖尿病大鼠和正常大鼠的种类是一致的，而且在尿液和粪便样品中，COP的代谢产物在二者之间的种类也是一致的；但二者胆汁中的代谢产物种类有差异，M4 在糖尿病大鼠胆汁中并未检出，M4 是代谢产物中唯一的硫酸酯化合物，是由COP 脱氢后生成M1 继续发生硫酸酯化形成的，糖尿病大鼠的胆汁代谢中缺少了COP 脱氢后变成M1的硫酸酯化的过程，因此在糖尿病大鼠胆汁中COP 脱氢后变成M1 后发生了其他的代谢反应生成了更多的M9、M11、M12、M13。本研究推测M1 在正常和糖尿病大鼠胆汁的代谢差异可能是COP 产生降糖作用的原因。

4 讨论

药物代谢也称为生物转化，是指药物在药物代谢酶作用下，其化学结构及理化性质发生改变的过程。肝脏和胃肠道是药物代谢的主要场所，多数药物进入机体后主要经肝脏进行代谢，代谢产物由肾脏经尿液排出，一些吸收较差的药物主要由粪便排出。由于药物的血药浓度与药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄（ADME）四个过程密切相关，而ADME 各环节往往需要体内广泛分布的转运体以及代谢酶的参与，因此，转运体和代谢酶的功能是影响药物的生物利用度的重要因素。

通过研究COP 体内的生物转化过程，本研究发现M0 脱氢生成M1 后，M1 共有5 条代谢途径，而在糖尿病大鼠胆汁中未检出M4，即M1 在糖尿病大鼠胆汁中的代谢未发生硫酸酯化反应，只发生了葡萄糖醛酸化和羟基化反应，从而生成了更多的羟基化产物和葡萄糖醛酸化产物。因此，本研究推测可能是由于在病理状态下M1 代谢路径的差异导致的代谢产物的量与正常状态下不同，从而产生了降糖作用。具体由M1 生成的多个代谢产物量上的差异，尚需进一步的针对性的研究验证。

对于代谢物的鉴定，解析质谱碎片离子裂解反应途径是推断代谢过程的关键。对于多数代谢物而言，可用质谱方法根据其MS、MS2 鉴定其结构，但有时仅凭m/z 不能完全确证，可通过NMR 等分析手段进一步确证。此外在结构鉴定中，代谢物具有较高的相对浓度和响应值是关键。

COP 是黄连中重要的一种生物碱，对黄连的有效成分在体内的代谢过程进一步阐明为临床应用提供基础，使黄连资源的研究、开发更全面，逐步走向成熟和规范化。同时，注重黄连有效成分药理活性的研究，充分发挥其独特的优势，使其更加有效地应用于临床[18]。