补肾填精法对肾精亏虚孕鼠脾脏及TLR4/MyD88/NF-κBp65免疫通路的影响＊

黄 敏，陈会敏，周艳艳，徐安莉，陈龙云，赵 敏

（湖北中医药大学基础医学院 武汉 430065）

中医认为，肾为先天之本，脾为后天之本，生化之源，以滋养育胎。基于机体的免疫调控机制来探讨肾虚型胎漏、胎动欲坠等症具有重要的临床意义，这也是目前中医临床上的研究热点[1-3]。

本课题组前期的研究表明，肾虚会影响Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表达，进而干扰机体的免疫水平[4]。TLR4 是一种跨膜蛋白受体，包括胞外区、跨膜区和胞内区三部分。胞外区参与细菌脂多糖、类脂A 和热休克蛋白60等多种病原相关分子模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP）的识别，激活先天性免疫反应，引起细胞因子释放，进而活化获得性免疫反应[5-6]。可见，TLR4 是连接天然免疫与特异性免疫的桥梁，是调控机体免疫的重要分子，具有重要的研究意义。

TLR 介导的免疫机制可分为MyD88 依赖性和MyD88 非依赖性两种[7]。MyD88 是TLR 的接头蛋白，有N 端死亡结构域和C 端的TIR 结构域（Toll/interleukin-1receptor（IL-1R）domain）。死亡结构域作用于IL-1R相关激酶（IL-1R-associated kinase，IRAK），引起IRAK 的自磷酸化。磷酸化的IRAK 进而通过活化IκB (inhibitor-κB)来激活NF-κB[8-9]。NF-κB 由p50和p65 构成，p50 负责结合DNA，p65 则结合抑制蛋白IκB。正常情况下，p65 与IκB 结合将NF-κB 限定于细胞浆中，阻止其入核。刺激条件下，IκB 磷酸化并降解，NF-κB被激活并入核结合特定DNA序列启动大量免疫介质的转录，引起免疫应激反应[10-11]。NF-κBp65在NF-κB 的激活和免疫因子的转录中起着重要的作用，国内外都有很多相关的最新研究[10-13]。我们前期了解到肾虚与TLR4 相关，但是肾精亏虚能否进一步作用于下游的MyD88和NF-κB仍需进一步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠90 只（雌∶雄=2∶1），8 周龄，体重200±20 g，许可证编号SCXK（鄂）2017-0012，由三峡大学实验动物中心提供。大鼠饲养于湖北中医药大学中医药实验中心SPF 级动物房，大鼠自由饮水和采食，室温22±2℃，光照明暗各12 h，适应性喂养1周后进行实验。

1.2 左归丸混悬液的制备

左归丸购自上海雷允上封浜制药有限公司，国药准字Z31020371，每粒重0.1 g。根据大鼠与人的体表面积换算公式，计算出大鼠剂量为0.58 g/100 g·d-1。据此，将左归丸配制成浓度为0.58 g·mL-1的混悬液，4℃冰箱备用。

1.3 主要试剂

Trizol 由Aidlab 公 司 提 供，货 号 为252250AX；SYBR Green Master Mix，由Vazyme 公司提供，货号为Q111-02；大鼠甲状腺素（T3 和T4）诊断试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供，货号为F16839 和F16840；小鼠单抗β-Actin 由武汉博士德生物工程有限公司提供，货号为BM0627；兔多抗NF-κBp65 由Abcam公司提供，货号Ab16502；兔多抗MyD88由武汉三鹰生物技术有限公司提供，货号为23230-1-AP；兔多抗TLR4，由武汉三鹰生物技术有限公司提供，货号为19811-1-AP；HRP 标记羊抗小鼠二抗，由武汉博士德生物工程有限公司提供，货号为BA1051；HRP 标记羊抗兔二抗，由武汉博士德生物工程有限公司提供，货号为BA1054。

1.4 主要仪器

模拟地震振动台（上海鼎盛机械制造厂），型号AB22001；组织摊烤片机（武汉俊杰电子有限公司），型号JK-6；显微镜（Olympus），型号BX53；病理切片机（德国Leica 公司），型号RM 2016；电镜（FEI 公司），型号TecnaiG2 20TWIN；实时荧光定量PCR 仪（ABI 公司），型号QuantStudio 6。

1.5 动物分组、肾精亏虚孕鼠模型建立及给药

大鼠适应性喂养后，按照比例（雌∶雄=2∶1）进行合笼配对。母鼠受孕后，按随机取数法分为正常组、模型组和补肾组，每组20 只。自怀孕第1 天起（受孕第一天定义为显微镜下看到阴栓的当天），模型组和补肾组每日采用梅花针叩击孕鼠头部和仿地震平台震动及包天桐的悬吊应激法三种因素复合造模，直至其分娩。

梅花针叩击孕鼠头部造模法：频率20 次/min，每次5 min，隔天一次，不定时。

仿地震平台震动造模法：每天不定时振动1 次(频率：垂直振动3 次，水平振动3 次)，每次持续5 min，每次单只放入仿地震平台造模。

包天桐的悬吊应激造模法：用胶布将孕鼠尾部距肛门1.5 ～2 cm 处固定在长木条上，在其正下方放置一缸水，水面恰及孕鼠鼠鼻，模拟时刻处于将溺水的危险状态，促使孕鼠有恐惧感。

哺乳期仔猪出现呕吐、腹泻症状，随后排出黄白色粥样稀便，卧地不起，强迫仔猪站立，仔猪行走时左右摇摆，行走不稳，不能正常吃乳，仔细观察发病猪四肢内侧存在紫色点状出血，发病猪腹泻物中夹杂不完全的白色凝乳块。随着病情进一步发展，腹泻症状严重，患病猪身体逐渐消瘦，不能正常行走，行走时左右摇晃，共济失调，四肢叉开，口吐白沫，叫声嘶哑，耳部和腹部皮肤表面发红，并出现绿豆大小的蓝紫色出血点。多数患病猪在发病中后期，排出黄色或黄褐色粥样稀便，病猪在临死前表现角弓反张，全身肌肉震颤，出现间歇性痉挛，后期肢体麻痹，呈现犬坐姿势，有时在圈舍中转圈或者侧卧时四肢划动呈游泳状，最后因机体衰竭而死。

补肾组自妊娠第一天起，予左归丸混悬液灌胃，灌胃剂量为1 ml/100 g·d-1，直至孕鼠分娩。正常组和模型组孕鼠自妊娠第一天起每日予生理盐水灌胃，灌胃剂量为1 ml/100 g·d-1，直至孕鼠分娩。

1.6 动物一般状态观测

实验过程中，每日观察各组孕鼠的神态、活动量、进食量、二便的排泻、被毛的生长荣枯、是否有先兆流产以及孕鼠胎产数。

1.7 检测孕鼠血清T3和T4含量

孕鼠产仔后，立刻取血。孕鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 ml·kg-1）麻醉，剪开腹壁，分离并剪断腹主动脉，取血5 ml 左右，静置30 分钟，离心（4℃、3000 r·min-1、15 min），分离血清，用大鼠甲状腺素（T3 和T4）诊断试剂盒进行检测。

1.8 脾脏显微结构检测

孕鼠分娩当天放血处死孕鼠，取脾脏组织，4%多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋，常规切片备用。HE 染色后用光学显微镜观察脾脏显微结构改变。

1.9 脾脏超微结构检测

取孕鼠脾脏组织切碎至1 mm3大小，用0.1 mol·L-1磷酸盐缓冲液冲洗3 次，经4%戊二醛固定2 h，1%锇酸固定1 h，梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片至4µm，铀铅双重染色后，电镜观察脾脏超微结构改变。

1.10 RT-PCR检测TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA表达水平

取孕鼠脾脏组织，采用Trizol 法提取总RNA，逆转录，并用RT-PCR 法测定上述三种mRNA的表达水平，引物参见表1。逆转录体系：5µg RNA、2µl Oligo(dT)18(10 µM)、4 µl dNTP (2.5 mM)、4 µl 5× Hiscript Buffer、1µl Hiscript Reverse Transcriptase、0.5µl Ribonuclease Inhibitor，补ddH2O（Rnase free）至体积为20 µl。逆转录反应条件：25℃5min，50℃15min，85℃5min，4℃10min。RT-PCR 体系：4 µl cDNA（8×稀释）、0.4 µl 上游引物、0.4 µl 下游引物、10 µl SYBR Green Master Mix、0.4µl 50×ROX Reference Dye 2、4.8µl H2O。RTPCR 条件：50°C 2 min，95°C 10 min；40 个循环条件：95°C 30 sec，60°C 30 sec。数据以2-ΔΔct法分析。

1.11 Western blotting检测TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白表达水平

取孕鼠脾脏组织，提取总蛋白质，并测定浓度。每组取50 µg 总蛋白先后进行两次SDS-PAGE 电泳：5%浓度，100 V，20 min；10%浓度，130 V，60 min。然后，60 V 3.5 h电转印于PVDF膜上。用封闭液将PVDF膜（1×TBST，5%脱脂奶粉）室温振摇封闭0.5 h。加入对应的一抗，4℃孵育过夜，1 × TBST 液洗膜3 次。加辣根过氧化物酶标记的二抗，并洗膜。加ECL 发光剂，显影、定影，胶片洗涤，干燥后观察并记录。

1.12 统计学处理

利用SPSS 22.0软件包进行统计学分析，结果用均数±标准差（±s）表示，组间比较进行t 检验，多组均数间两两比较采用方差分析，P<0.05 为组间有差异，有统计学意义。

2 结果

2.1 孕鼠一般情况及血清T3、T4的比较

如表2所示，正常组孕鼠活动度好，采食量与饮水量正常，产仔正常。与正常组孕鼠比较，模型组孕鼠出现体毛脱落枯疏且无光泽、易惊恐、拱背蜷缩、喜聚集扎堆、采食量与饮水量减少和大便软稀等症状，结合中医辩证和恐伤肾的病因病机，说明模型组孕鼠存在肾精亏虚症。同时，模型组胎产数量明显降低，仔鼠活动度较差，且有2 只孕鼠出现流产，有2 只孕鼠出现早产，并娩出少量死胎，表明复合应激法所致的肾精亏虚会导致孕鼠的生殖能力下降。此外，模型组孕鼠血清甲状腺激素（T3和T4）的水平明显低于对照组，提示模型组孕鼠甲状腺机能减退，基础代谢降低，进一步证实模型组孕鼠存在肾精亏虚（表2）。与模型组孕鼠比较，补肾组孕鼠较平静，无明显惊恐和流产现象，其胎产数量和仔鼠活动度尚可，可见少量无尾畸胎。同时，补肾组血清甲状腺激素（T3和T4）的水平明显回升，这表明补肾填精方左归丸可以改善肾精亏虚孕鼠的生存状态、生殖功能和基础代谢水平。

表1 引物序列表

表2 孕鼠一般情况及血清T3、T4的比较

2.2 孕鼠脾脏组织显微结构的比较

结果如图1所示，正常组孕鼠脾脏结构致密，淋巴小结边界清晰，红髓、白髓结构完整，淋巴细胞排列致密整齐，细胞未见明显的分裂分化现象（图1A-1C）。与正常组孕鼠比较，模型组孕鼠脾脏结构稀疏，脾小梁增宽，较多的淋巴小结面积缩小且界限模糊，白髓内淋巴细胞数量大量减少且排列稀疏分散，并出现部分坏死的淋巴细胞（图1D-1F），表明复合应激法所致的肾经亏虚会导致孕鼠脾脏组织的显微结构出现异常。与模型组孕鼠比较，补肾组孕鼠脾脏结构稍稀疏、白髓结构轻度改变，淋巴小结界限较清晰，淋巴细胞的数量有恢复（图1G-1I），表明补肾填精方左归丸可以使模型组孕鼠的脾脏显微结构部分恢复正常。

图1 孕鼠脾脏组织显微结构的比较（HE染色×100，×200，×400）

2.3 孕鼠脾脏组织超微结构的比较

结果如图2 所示，正常组孕鼠脾脏内未见明显的细胞凋亡和坏死现象（图2A）；细胞内的细胞核核膜平滑，核内染色质较浓，且核膜附近的染色质较多（图2B）；同时，胞浆中各细胞器结构正常，线粒体内可见清晰的嵴状结构（图2C）。与正常组孕鼠比较，模型组孕鼠脾脏内有明显的细胞凋亡和坏死现象（图2D）；细胞内的细胞核核膜不规则，部分核膜有明显的凹凸不平现象，核内染色质出现不同程度的固缩（图2E）；同时，胞浆中部分细胞器崩解，有的线粒体出现水肿和嵴状结构受损（图2F）；表明复合应激法所致的肾精亏虚会导致孕鼠脾脏组织的超微结构出现异常。与模型组孕鼠比较，补肾组孕鼠脾脏内的细胞凋亡和坏死现象明显减少（图2G）；细胞内的细胞核核膜不规则和染色质固缩现象减轻（图2H）；胞浆中的细胞器和线粒体形态明显恢复（图2I）；表明表明补肾填精方左归丸可以使模型组孕鼠的脾脏超微结构部分恢复正常。

2.4 孕鼠脾脏组织中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 mRNA表达水平的比较

结果如图3所示，与正常组比较，模型组孕鼠脾脏中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 的mRNA 表达水平显著降低（ΔP < 0.01），表明复合应激法所致的肾精亏虚会导致孕鼠脾脏中的TLR4 免疫通路相关基因的mRNA水平受到抑制。与模型组比较，补肾组孕鼠脾脏中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 的mRNA 表达水平明显回升（▲P<0.01），表明补肾填精方左归丸能够上调TLR4免疫通路中相关基因的mRNA水平。

图2 孕鼠脾脏组织超微结构的比较（电镜×1700，×5000，×11500）

图3 孕鼠脾脏组织中TLR4、MyD88和NF-κBp65 mRNA表达水平的比较

图4 孕鼠脾脏组织中TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表达水平的比较

2.5 孕鼠脾脏组织中TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白表达水平的比较

结果如图4所示，与正常组比较，模型组脾脏组织中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 蛋白的表达水平显著降低（ΔP <0.01），表明复合应激法所致的肾精亏虚会导致孕鼠脾脏中的TLR4 免疫通路相关基因的蛋白质表达受到抑制。与模型组比较，补肾组孕鼠脾脏中TLR4、MyD88 和NF-κBp65 蛋白质的表达水平明显回升（▲P<0.01，＃P<0.05），表明补肾填精方左归丸能够上调TLR4免疫通路中相关基因的蛋白质水平。

3 总结与讨论

恐是中医五志之一，长时间的过度恐惧会有损机体健康[14]。《素问·阴阳应象大论》中提出了“恐伤肾”理论。本实验根据该理论采用复合应激法复制出肾精亏虚“恐伤孕鼠”模型[15-16]。中医的“肾”本质上包括了下丘脑-垂体-肾上腺皮质、甲状腺、性腺体的功能。目前，肾虚证动物模型的判断依据主要是其是否有类似于人的肾虚证临床表现以及其甲状腺、肾上腺、生殖能力和免疫水平是否出现紊乱[17]。本实验中，模型组孕鼠出现了喜欢扎堆、蜷缩拱背、口唇苍白、双眼无神、食欲减退、大便质地较稀和皮毛枯疏无华等症状，也出现了流产、早产、胎产数量明显减少、产下死胎和甲状腺激素（T3和T4）的水平降低等现象，结合中医辩证和恐伤肾的病因病机，说明本实验的肾精亏虚模型是成功的。左归丸是具有补肾填精作用的经典方剂[18-19]。本实验中，左归丸干预的补肾组孕鼠的生存状态、生殖功能和甲状腺激素水平都得到了显著改善，这与文献报道的左归丸能提高生殖能力和调节肾精亏虚症状的结论一致[20-22]。

机体免疫功能的强弱与中医理论中的“卫气”密切相关。中医认为，卫气源于下焦肾气，生于中焦脾胃所化生的后天之气，最后借助于肺的宣发和肃降功能布于全身肌表，发挥其抗御之能。故此，免疫功能与机体的肺、脾、肾有关。肾精亏虚已被证实能影响机体的免疫功能[21-22]。基于此，本实验以孕鼠的免疫器官—脾脏为靶标，探究“恐伤肾”对其免疫水平的影响。结果表明，模型组孕鼠脾脏结构稀疏，脾小梁增宽，较多的淋巴小结面积缩小且界限模糊，白髓内淋巴细胞数量大量减少且排列稀疏分散，并出现部分坏死的淋巴细胞。电镜结果进一步证实模型组孕鼠脾脏内有细胞凋亡和坏死现象，细胞内的细胞核核膜不规则，部分核膜有明显的凹凸不平现象，核内染色质出现不同程度的固缩；同时，胞浆中部分细胞器崩解，有的线粒体出现水肿和嵴状结构受损。这些形态学的改变都提示“恐伤肾”模型组孕鼠的脾脏组织出现了异常，而这种结构异常可能是模型组孕鼠免疫功能受损的原因之一。左归丸干预的补肾组孕鼠的脾脏结构稍稀疏、白髓结构轻度改变，淋巴小结界限较清晰，淋巴细胞的数量有所恢复；同时，脾脏内的细胞凋亡和坏死现象明显降低，细胞内的细胞核核膜不规则和染色质固缩现象减轻，胞浆中的细胞器和线粒体形态明显恢复。本实验的结果表明，左归丸能有效改善肾精亏虚孕鼠脾脏的结构，这与已有的左归丸能改善免疫功能的结论具有一致性[21-22]。但是，本实验选用脾脏为靶标，来探究“恐伤肾”及左归丸干预对其的影响，能更进一步论证肾精亏虚与补肾填精与机体免疫系统的关系。

本课题组前期的研究表明，肾虚会影响TLR4 的表达[4]。TLR 可以识别外源的病原体和内源性物质及降解物，是连接天然免疫与特异性免疫的主要桥梁[5-6]。本次实验发现模型组大鼠脾脏中TLR4 蛋白和基因的表达明显减少，推测TLR 通路及下游中的相关因子会受到影响。TLR4 主要是通过触发MyD88 进行细胞内信号转导，进而激活NF-κB 并启动下游基因的表达。NF-κB由p50和p65构成，通常p65与抑制蛋白IκB 结合将NF-κB 限定于细胞浆中。刺激条件下，外源性或/和内源性配体与TLR4 结合并呈递给胞内MyD88，随后通过级联反应磷酸化并降解IκB，NF-κB与IκB解离并活化入细胞核启动并调控下游基因的转录[10-11]。本实验发现肾精亏虚模型组孕鼠脾脏内的MyD88 和NF-κBp65 的mRNA 表达水平和蛋白表达水平都明显下调，这表明肾精亏虚会降低孕鼠脾脏中的TLR4 的表达，并通过MyD88 的传导作用于靶标因子NF-κBp65。补肾填精方左归丸干预能显著地逆转模型孕鼠脾脏内上述三种因子的下降，说明左归丸能借助于激活TLR4/MyD88/NF-κBp65 通路来调控肾精亏虚引发的模型孕鼠免疫功能紊乱。临床上已有研究开始探讨肾虚与TLR4 及其下游免疫通路的关系。谭从娥等[23]发现右归丸干预可以下调肾阳虚患者外周血中的TLR4 的表达而上调My D88 及NF-κB 的表达。这与本研究中左归丸干预肾精亏虚大鼠脾脏中的TLR4 的变化趋势相反，但是与My D88 及NF-κB 的变化趋势一致。张扬等[24]发现温肾方可提高肾阳虚型高丙氨酸氨基转移酶水平慢性乙型肝炎患者的外周血中的TLR4 活性以发挥其抗病毒疗效。这与本研究中左归丸干预肾精亏虚大鼠脾脏中的TLR4 的变化趋势一致。可见，近几年，TLR4/Myd88/NF-κB 通路在探究肾虚与免疫的关系中引发了较大的关注，但其具体的分子机制仍不清楚。

综上所述，本实验结果显示肾精亏虚孕鼠的脾脏结构出现改变，左归丸干预可以有效改善这些变化，这能很好地补充已有的肾精亏虚相关的中医藏象理论与实验研究工作。本实验结果进一步揭示肾精亏虚孕鼠脾脏中的TLR4、MyD88 和NF-κBp65 三种因子的mRNA 和蛋白质表达水平都明显下调，左归丸干预可以有效逆转该通路的下降趋势，这说明该通路可能是补肾填精法治疗肾精亏虚引发的免疫紊乱的靶标通路，为中医药治疗肾精亏虚相关的免疫功能缺陷病证的研究提供了一定的依据。同时，中医认为，肾为先天之本,脾为后天之本,生化之源,以滋养育胎。本实验中的左归丸干预不仅能有效改善孕鼠脾脏的结构变化和TLR4/MyD88/NF-κBp65 免疫通路的变化也能显著地提高孕鼠的生育能力，这进一步证实了基于机体的免疫调控机制来探讨肾虚型胎漏、胎动欲坠等症具有重要的临床意义。