伊贝母异甾体生物碱通过Wnt/β-catenin信号通路调节哮喘大鼠气道炎症和气道重塑机制的研究＊

焦豪妍，刘 瑶，薛 雪，汤庆发

（1. 广东食品药品职业学院药学院 广州 510520；2. 南方医科大学中医药学院 广州 510515；3. 广东省中药制剂重点实验室 广州 510515）

在世界范围内，支气管哮喘（哮喘）是一种严重威胁人类健康的呼吸系统疾病，是由多种炎症细胞及其组分参与的慢性气道疾病。气道炎性细胞浸润程度与病情轻重程度密切相关[1]。气道重塑是支气管哮喘的特征性病理改变[2]，主要是指气道壁结构的改变，包括气道壁增厚、上皮下基底膜增厚、纤维化、细胞外基质沉积、气道平滑肌细胞（ASMC）增生肥大等，上述结构的变化会引起气道阻塞，严重时将危及患者的生命[3]。

目前，临床上通常给予哮喘患者糖皮质激素、支气管扩张剂等药物进行治疗，这些药物短期内虽能缓解哮喘症状，但难以根治、易复发，而且对气道重塑的治疗作用不显著[4]。由于缺乏有效的治疗药物，气道重塑成为哮喘治疗中最棘手的问题之一。

传统中药治疗咳喘病经验丰富、具有独特优势且安全性高。因此，从传统中药中寻找和开发安全有效的哮喘治疗药物具有重要的临床意义。伊贝母为百合科植物新疆贝母Fritillaria walujewii Regel 或伊犁贝母Fritillaria pallidiflora Schrenk的干燥鳞茎，为药用贝母之一，具有清热润肺、化痰、止咳、平喘之功效，临床主要用于咳喘病的治疗[5-6]。近年来，由于贝母中发挥止咳平喘药效的主要活性成分为异甾体生物碱，而伊贝母所含异甾体生物碱的总量在同类贝母中相对较高[7-9]，这使得贝母倍受关注。

异甾体生物碱可通过作用于气管壁M 受体舒张气管、降低气道高反应性，从而起到平喘的作用[10]，但是其对气道炎症和气道重塑的调节作用及机制并不明确。Wnt/β-catenin 信号通路是哮喘发生发展过程中非常重要的一条信号通路，有研究表明，该通路与气道炎症和气道重塑有着密切的关系[11]。因此，本论文采用卵清蛋白（OVA）致敏和激发的大鼠哮喘模型，首次研究伊贝母异甾体生物碱对哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的调节作用，并基于Wnt/β-catenin 信号通路探讨其可能的作用机制，为伊贝母药材的深入开发和使用奠定基础。

1 实验材料

1.1 仪器

BP211D 电子分析天平（德国Sartorius 公司），YLS-8A 诱咳引喘仪（山东省医学科学设备站），HC-3018R 高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器公司），GC03 旋转蒸发器（上海申生科技有限公司），Thermo FC 酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司），JB-P5 石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司），RM2016 切片机（上海徕卡仪器有限公司），KD-P 组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司），ECLIPSE CI 正置光学显微镜（日本尼康），DS-U3 成像系统（日本尼康）。

1.2 药物及试剂

伊贝母药材购自广州东方大药房，经广东食品药品职业学院刘晓春教授鉴定为百合科植物伊犁贝母Fritillaria pallidiflora Schrenk 的干燥鳞茎；OVA（北京百灵威科技有限公司，纯度98%）；氢氧化铝（广州化学试剂厂，分析纯）；大鼠白介素4（IL-4）、白介素5（IL-5）和 白 介 素13（IL-13）的 酶 联 免 疫 吸 附 法（ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）；Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 抗体（上海瑞齐生物科技有限公司）。

1.3 实验动物

SD 雄性大鼠40 只，体重为200-250 g，动物许可证号：SCXK（粤）2016-0041，购买于南方医科大学动物中心。

1.4 样品的制备

取伊贝母粉适量置于圆底烧瓶中，加入95%乙醇500 ml，放置于80℃恒温水浴锅中回流提取6h，提取3次，抽滤，合并滤液，减压回收乙醇得稠浸膏，加入蒸馏水悬浮浸膏，加入1 mol·L-1NaOH 调至pH10，然后用乙酸乙酯多次萃取，萃取液合并，后真空浓缩得到异甾体生物碱浸膏。

2 实验方法

2.1 大鼠哮喘模型的建立及给药

将40 只SD 大鼠随机分为四组，即健康组、哮喘组、阳性药组（地塞米松）和异甾体生物碱组，每组10只。除健康组外，其余各组分别于第0 天、第7 天和第14天，麻醉下在足跖、两侧腹股沟、腰、背、胸部等共取10 点，每点皮下注射OVA 和氢氧化铝混悬液致敏，同时腹腔注射混悬液。第15 天开始，除健康组外，每组大鼠早晨雾化吸入OVA 30 min，健康组用等体积生理盐水替代，进行哮喘大鼠模型的激发，雾化持续7 天，同时各组与雾化前30 min 给予相应的药物：阳性药组灌胃给予地塞米松片0.5 g·kg-1，异甾体生物碱组灌胃给予异甾体生物碱浸膏70 mg·kg-1，健康组及哮喘组灌胃给予生理盐水。

2.2 样本的采集及指标的检测

标本的采集：末次激发2 h 后麻醉大鼠，打开胸腔结扎右支气管，从气管插管处用生理盐水进行支气管肺泡灌洗，来回冲洗3 次，合并收集肺泡灌洗液（BALF）。切取未经灌洗的大鼠肺组织，采用4%多聚甲醛预先固定，石蜡包埋，切片，用常规苏木精-伊红（HE）染色法染色，其余肺组织液氮保存用于Western blot检测。

BALF 中细胞分类计数：吸取1.5 mL BALF 于全自动五分类动物分析仪，进行白细胞分类计数，计数包括白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞的数目。

BALF 中细胞因子IL-4、IL-5 和IL-13 的检测：采用ELISA 测定各样本IL-4、IL-5和IL-13的水平，测定过程严格按照试剂盒说明书进行。

支气管壁和平滑肌厚度：将制作好的肺组织切片置于400 倍光学显微镜下，观察各组大鼠肺组织的变化和支气管周围炎症细胞浸润程度，应用图像分析软件测量肺组织支气管基膜周径（Pbm），支气管壁厚度（Wat）= [支气管总厚度（Wat1）- 管腔厚度（Wat2）]/Pbm，平滑肌厚度（Wam）= [平滑肌外缘内气管厚度（Wam1）-平滑肌内缘内气管厚度（Wam2）]/Pbm。

Western blot 法测定肺组织中Wnt5a、Wnt7b 和βcatenin 蛋白含量变化：肺组织样品加入裂解液，于冰上裂解后离心收集上清。采用蛋白浓度检测法检测肺组织蛋白上清液中Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 的蛋白含量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离目标蛋白条带，随后将上述目标蛋白转印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，采用脱脂奶粉封闭后分别用Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 抗体孵育过夜，继而二抗室温孵育1 h，最后用ECL化学发光试剂进行显影成像。结果用ImageJ2 软件分析测定Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 条带的积分光密度值的峰面积，分析蛋白的含量变化。

2.3 统计分析

各组数据均以平均值± S 表示，采用SPSS18.0 统计软件进行方差分析，比较各组间的差异，P<0.05 时有显著性差异。

3 结果

3.1 BALF中白细胞分类计数

各组计数结果见图1，与健康组比较，哮喘组中的白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞数和嗜酸性粒细胞数显著增加（P < 0.01），符合支气管哮喘的病理特征。阳性药和异甾体生物碱组均能够显著降低白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的数目，这表明伊贝母中的异甾体生物碱具有良好的抗炎作用。

3.2 BALF中细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的检测

各组测定结果见图2，与健康对照组比较，模型组大鼠BALF 中IL-4、IL-5 和IL-13 的水平显著升高，与健康组比较，有显著差异（P<0.01）。给予药物后，阳性药物和异甾体生物碱组均显示出调节作用（P <0.05），但是阳性药物组的调节作用更显著。

3.3 组织病理学检查

图1 各组BALF白细胞分类计数结果（±s,n = 10）

图2 各组BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平测定结果（n = 10）

图3 各组动物肺组织病理学典型切片

在显微镜下观察大鼠HE 染色结果，各组典型切片见图3，健康组肺组织结构正常，未见炎性细胞浸润；哮喘组呈现显著的支气管管腔狭窄现象，且支气管壁厚度和平滑肌厚度均显著增加，肺泡间质可见大量炎性细胞浸润；阳性药组和伊贝母异甾体生物碱组与哮喘组比较，炎症浸润和气道重塑现象均明显改善。

3.4 支气管壁和平滑肌厚度测定结果

测定结果如图4所示，与健康组比较，哮喘组支气管壁和平滑肌厚度均显著升高（P < 0.01），显示出气道重塑的病理特征。给予阳性药物和伊贝母异甾体生物碱后，两者均显著降低，且与哮喘组比较，有统计差异（P < 0.05），说明伊贝母异甾体生物碱能干预气道重塑。

3.5 Western blot测定结果

Western blot 分 析 肺 组 织 中Wnt5a、Wnt7b 和βcatenin蛋白表达和含量变化结果见图5和图6，与健康组比较，哮喘组肺组织中Wnt5a、Wnt7b和β-catenin 的蛋白含量显著增高，提示Wnt/β-catenin 信号通路在支气管哮喘大鼠模型中被异常激活，而给予伊贝母异甾体生物碱后，Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 均显著降低，与模型组比较，有显著差异，提示药物可能是通过调节Wnt/β-catenin信号通路干预气道炎症和气道重塑。

4 讨论

Wnt/β-catenin 信号通路与哮喘气道炎症密切相关。哮喘被认为是一种与激活适应性免疫反应有关的疾病，其最显著的表现是Th2 细胞依赖性促进免疫球蛋白的产生和肥大细胞的募集；同时，哮喘的特征还表现为先天性免疫反应，影响树突状细胞（DC）的激活和转运，产生先天性免疫细胞因子，以及淋巴细胞的启动[12]，上述两个过程均和Wnt/β-catenin 信号转运密切相关。

在对哮喘患者外周血单核细胞（PBMCs）分析过程中发现，随着IL‑4、IL‑5、IL‑13水平的增高，Wnt5a的表达也显著增加，同时发现抗IL‑13 单抗可以完全阻止Wnt5a的表达[13]。有研究表明，Wnt5a与气道平滑肌（ASM）收缩有关，而ASM 密切参与调节气道炎症，因此Wnt/β-catenin 信号通路与气道炎症特别是过敏反应密切相关[14]。

Wnt/β-catenin 信号通路与哮喘气道重塑也密切相关。有研究发现[15]，β-catenin在细胞的生长、增殖以及稳态的维持中具有重要作用，支气管过度收缩或拉伸可以激活β-catenin，并使其在气道上皮以细胞增殖、分化和细胞外基质生产等方式参与组织修复、促纤维化以及哮喘气道重塑。此外，有研究[16-17]指出，βcatenin 参与气ASMC 的有丝分裂过程，其可在ASMC核内聚集和转移，对ASMC 的生长具有重要的维持作用。因此，β-catenin 的激活是产生气道重塑的一个关键机制。

图4 各组对支气管哮喘大鼠支气管壁厚度及平滑肌厚度的影响（±s,n = 8）

图5 各组大鼠肺组织中Wnt5a、Wnt7b和β-catenin蛋白表达

图6 大鼠肺组织Wnt5a、Wnt7b和β-catenin蛋白的含量变化（±s,n = 8）

Wnt7b 是Wnt 信号通路配体之一，主要在肺组织上皮表达，在胚胎时期便参与肺的发育和维持血管平滑肌的完整[18]。有报道指出[19-20]，Wnt7b 能够调控肺部平滑肌细胞的发育，其表达失衡与气道重塑密切相关。Wnt5a 是ASMC 产生的最主要的Wnt 信号通路配体，哮喘患者ASMC 中Wnt5a 的表达与正常人群相比明显增加；Wnt5a 通过自分泌信号促进ASMC 中肌动蛋白的聚合，肌动蛋白的聚合使ASMC收缩力增加，加重了气道重塑［21-22］。

本研究显示，与模型组比较，伊贝母异甾体生物碱组大鼠BALF 中白细胞总数、中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞数目均显著降低，BALF 中炎症因子IL-4、IL-5和IL-13的浓度也显著降低，组织病理学检查显示肺泡间质炎性细胞浸润明显改善，上述结果说明伊贝母异甾体生物碱对哮喘气道炎症有抑制作用。同时，异甾体生物碱组大鼠支气管管腔狭窄显著改善，支气管壁厚度和平滑肌厚度均明显降低，这说明异甾体生物碱对哮喘气道重塑也有抑制作用；Western blot 测定结果显示，异甾体生物碱对哮喘大鼠Wnt/βcatenin 通路上的Wnt5a、Wnt7b 和β-catenin 蛋白表达有显著的调节作用。据此，本研究推测伊贝母异甾体生物碱可能是通过抑制Wnt5a 或者Wnt7b 的蛋白表达，从而抑制β-catenin 激活，进而阻止了哮喘气道炎症和气道重塑的发生发展。伊贝母异甾体生物碱对哮喘的治疗作用与Wnt/β-catenin信号通路密切相关。