漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞乳成分合成的影响

■刘莉莉 杨炳友

（黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨150040）

羊奶作为乳制品营养丰富，消化吸收率高，是小孩、老人以及病人的重要营养品，也是青壮年的保健品，然而我国畜牧业普遍存在产奶动物奶产量低，奶中的乳蛋白含量和乳脂率不高等问题，严重影响我国乳业的发展，故安全有效地增加产奶动物的乳产量对于人们生活质量的提高和我国乳业的发展有着重要意义。中药源自天然，其资源丰富，可为泌乳动物提供营养物质，还可以发挥一定的药理作用，其毒副作用小，用于增乳有其独特优势[1-2]。

漏芦为菊科植物祁州漏芦[Rhaponticum uniflo⁃rum (L.) DC.]的干燥根，具有清热解毒、消痈、下乳、舒筋通脉的作用[3]。含有漏芦的复方增乳中药在临床和畜牧业生产中具有一定的应用[4-5]，但目前的研究多侧重于其促进产妇催乳及动物泌乳的效果，而有关漏芦对产奶动物乳腺泌乳的调控机制研究国内外报道少。本实验探讨漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞乳成分合成能力的影响以及其对乳成分合成代谢的影响，为中药漏芦对哺乳动物泌乳调节机制的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

中药漏芦购自黑龙江省药材公司，由黑龙江中医药大学于丹副教授鉴定为菊科药用植物祁州漏芦[Rhaponticum uniflorum (L.) DC.]的干燥根。奶山羊乳腺上皮细胞由东北农业大学动物生物化学教研室提供。优质胎牛血清、DMEM/F12 培养基，Gibco 公司生产；Lactose/D-Galactose (Rapid) Assay Kit，购自Mega⁃zyme 公司；甘油三酯定量检测试剂盒，购自普利莱基因技术公司；β-酪蛋白（CSN2）检测试剂盒，购自Us⁃cn Life Science 公司；实时荧光试剂盒SYBR®Primx ExTaqTM，TaKaRa 公司生产；TRIzol，Invitrogen 公司生产；Prime ScriptTMRT reagent Kit，TaKaRa公司生产。

1.2 漏芦乙醇提取物的制备

将祁州漏芦切碎后，用90%乙醇回流提取2 h，共3次，合并滤液，经减压浓缩即得漏芦乙醇提取物，得率为8.9%。使用前先用少量二甲基亚砜(DMSO)助溶，再用完全培养基配成实验所需浓度，过滤除杂除菌备用。

1.3 奶山羊乳腺上皮细胞培养

采 用 生 长 培 养 基（DMEM/F12 ＋10%FBS）于37 ℃、5% CO2条件下培养奶山羊乳腺上皮细胞，每隔24 h更换培养基。

1.4 引物设计

使用Primer6.0 软件设计各基因qRT-PCR 的上游、下游引物（见表1）。

表1 基因的qRT-PCR引物序列

1.5 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞合成乳成分能力影响的检测

收集对数生长期的奶山羊乳腺上皮细胞接种于6 孔板中，待细胞融合度达到70%～80%时，更换新鲜培养基，对照组细胞添加正常细胞培养基，各实验组细胞在添加正常细胞培养基的基础上添加不同剂量的漏芦乙醇提取物（质量浓度分别为25、50、100 μg/ml，药物添加浓度根据前期实验摸索而确定），每组5 个平行。漏芦乙醇提取物作用奶山羊乳腺上皮细胞48 h，收集细胞培养液，采用β-酪蛋白（CSN2）检测试剂盒、Lactose/D-Galactose (Rapid) Assay Kit 和甘油三酯定量检测试剂盒检测乳腺上皮细胞分泌到培养液中β-酪蛋白、乳糖和甘油三酯含量。

1.6 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞乳成分合成代谢影响的检测

收集对数生长期的奶山羊乳腺上皮细胞接种于6 孔板中，待细胞融合度达到70%～80%时，更换新鲜培养基，对照组细胞添加正常细胞培养基，各实验组细胞在添加正常细胞培养基的基础上添加不同剂量的漏芦乙醇提取物（质量浓度分别为25、50、100 μg/ml），每组5 个平行。漏芦乙醇提取物作用奶山羊乳腺上皮细胞48 h，收集乳腺上皮细胞，Trizol法提取乳腺上皮细胞中RNA，根据逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，利用qRT-PCR 技术检测奶山羊乳腺上皮细胞乳糖合成相关酶：己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）和β-1,4-半乳糖基转移酶（β-1,4-GT）基因的mRNA表达水平；检测乳蛋白转录和翻译相关蛋白：E74-样转录因子5（ELF5）、核糖体S6 激酶1（S6K1）基因的mRNA 表达水平；检测甘油三酯合成关键酶：甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT）、酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶6（AG⁃PAT6）和二酰基甘油酰基转移酶-1（DGAT1）基因的mRNA 表达水平[6]。各基因的qRT-PCR 结果采用2-ΔΔCT相对定量的方法（β-actin 基因为参照基因）计算目的基因的mRNA表达丰度。

1.7 数据处理

实验数据均以“平均数±标准差”（mean±SD）表示；采用SPSS 19.0 软件对实验数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞合成乳成分能力的影响

采用25、50、100 μg/ml的漏芦乙醇提取物处理奶山羊乳腺上皮细胞48 h，收集细胞培养液，利用β-酪蛋白、乳糖和甘油三酯检测试剂盒检测培养液中乳糖、β-酪蛋白和甘油三酯含量。结果如图1～图3 所示，与对照组相比，25、50、100 μg/ml的漏芦乙醇提取物以浓度依赖的方式显著提高奶山羊乳腺上皮细胞合成分泌主要乳成分β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖的能力(P＜0.05)。

图1 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞培养液中β-酪蛋白含量的影响

2.2 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞乳成分合成代谢的影响

采用25、50、100 μg/ml的漏芦乙醇提取物处理奶山羊乳腺上皮细胞48 h，提取总RNA，荧光定量RTPCR 检测乳蛋白、甘油三酯和乳糖合成相关酶和蛋白因子mRNA 的表达变化。结果如图4～图6 显示，与对照组相比，25、50、100 μg/ml 的漏芦乙醇提取物能以浓度依赖的方式显著提高乳蛋白转录和翻译相关蛋白ELF5、S6K1 基因的mRNA 表达水平（P＜0.05）（见图4）。

图2 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞培养液中甘油三酯含量的影响

图3 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞培养液中乳糖含量的影响

图4 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞乳蛋白合成相关蛋白ELF5和S6K1基因mRNA表达的影响

与对照组相比，25、50、100 μg/ml 的漏芦乙醇提取物能以浓度依赖的方式显著上调甘油三酯合成关键酶GPAT、AGPAT6 和DGAT1 基因的mRNA 表达水平（P＜0.05）（见图5）。

与对照组相比，25、50、100 μg/ml 的漏芦乙醇提取物能以浓度依赖的方式显著上调乳腺上皮细胞乳糖合成相关酶HKⅡ、β-1,4-GT基因的mRNA表达水平（P＜0.05）（见图6）。

图5 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞甘油三酯合成关键酶GPAT、AGPAT6和DGAT1基因mRNA表达的影响

图6 漏芦乙醇提取物对奶山羊乳腺上皮细胞乳糖合成相关酶HKⅡ和β-1,4-GT基因mRNA表达的影响

本研究表明漏芦乙醇提取物能提高乳腺上皮细胞乳糖成分合成代谢相关酶（HKⅡ、β-1,4-GT）、甘油三酯合成关键酶（GPAT、AGPAT6 和DGAT1）和乳蛋白转录和翻译相关蛋白（ELF5 和S6K1）的基因表达，进而促进奶山羊乳腺上皮细胞乳糖、乳脂和乳蛋白的合成。

3 讨论

哺乳动物的乳汁主要含有乳蛋白、乳脂和乳糖等营养成分，可为人类提供营养和能量。研究发现一些中药能加强乳腺代谢话动，改善乳成分含量，提高乳品质。毛智斌等[7]发现葎草黄酮能上调奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达量。Wan等[8]表明王不留行催乳活性物质能提高奶牛乳腺上皮细胞的活力和增殖能力，并能明显促进乳腺细胞β-酪蛋白的表达和乳糖的分泌。郑涛等[9]给母鼠灌胃通草提取液，证实乳腺上皮细胞中β-酪蛋白及乳清蛋白mRNA 的表达显著提高。本研究采用漏芦乙醇提取物（25、50、100 μg/ml）作用奶山羊乳腺上皮细胞，发现漏芦乙醇提取物能以浓度依赖的方式显著提高乳腺上皮细胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖，表明漏芦也能促进奶山羊乳腺上皮细胞乳成分的合成。

乳腺内乳蛋白、乳脂及乳糖的生物合成过程需要多种酶、功能蛋白以及泌乳信号通路相关信号分子的参与[10]。哺乳动物乳腺乳蛋白的合成与JAK2/STAT5和mTOR 途径密切相关。JAK2-STAT5a 是在转录水平上调节乳蛋白合成的重要信号通路[11]，mTOR-S6K1是在翻译水平调节乳蛋白合成的重要信号通路[12]，两个通路共同发挥作用促进乳蛋白的合成。ELF5是可以辅助STAT5 调控乳蛋白合成的潜在细胞因子，在泌乳期表达显著上调，影响泌乳过程关键基因的表达[13]。ELF5 的表达也受到了STAT5 的调控，并能增加STAT5 的活性，调节乳腺上皮细胞的分化促进泌乳[14]。mTOR 能够促进S6K1 磷酸化，增强含嘧啶基因mRNA的翻译，进而调节蛋白质的合成[15]。王不留行增乳活性成分能促进乳腺上皮细胞ELF5基因的表达[16]。孟海洋等[17]研究发现王不留行能上调奶牛乳腺上皮细胞p-STAT5、p-mTOR 和S6K1 蛋白的表达水平。本实验结果表明漏芦乙醇提取物能促进乳腺上皮细胞乳蛋白转录和翻译相关蛋白ELF5 和S6K1 基因的mRNA表达水平，推测漏芦提取物在乳蛋白合成过程中可能通过提高ELF5 的表达，进一步增强STAT5的活性，并且漏芦提取物可能经过一系列的级联反应激活p-mTOR，进而激活其下游的S6K1，从而促进乳蛋白质的合成。

甘油三酯（TAG）是乳脂中最主要的脂类物质（大于95%），TAG在乳腺上皮细胞的内质网上合成，来自从头合成途径的脂酰辅酶A和外源摄取的FA被酯化到甘油-3-磷酸骨架上形成TAG[18]。GPAT、AGPAT6、LPIN1、DGAT1等参与催化甘油三酯的合成[19]，这些酶也是乳腺中参与脂肪合成的关键酶[20]。GPAT能催化甘油-3-磷酸sn-1 位点的酯化，AGPAT 催化sn-2 位点酯化，DGAT 位于内质网膜上，对于甘油三酯合成来说它是一种特殊的酶，DGAT 被认为可能也是甘油三酯合成的限速酶[21]。丁月云[22]研究发现用中草药黄芪、王不留行作用奶牛乳腺上皮细胞后，细胞中脂滴数量增多，体积较大且分布较密。本研究表明漏芦乙醇提取物能提高乳腺上皮细胞甘油三酯合成关键酶GPAT、AGPAT6和DGAT1基因的mRNA表达水平，说明漏芦可能通过正向调节甘油三酯合成关键酶的表达，进而促进乳腺上皮细胞对甘油三酯的合成与分泌。

乳糖是乳中唯一的糖类，乳糖的生物合成是泌乳乳腺腺泡上皮细胞特有的功能，在高尔基体内进行。HKⅡ主要催化葡萄糖进入合成途径代谢，葡萄糖被HKⅡ磷酸化为6-磷酸葡萄糖，继而通过葡萄糖-6-磷酸变位酶转化为葡萄糖-1-磷酸，在三磷酸尿苷(UTP)的作用下生成二磷酸尿苷(UDP)-葡萄糖进而生成一分子的UDP-半乳糖，葡萄糖和UDP-半乳糖在乳糖合成酶催化下合成乳糖[23]。乳糖合成酶由β-1,4-半乳糖基转移酶（β-1,4-GT）及必需辅助因子α-乳白蛋白（α-LA）组成，其中β-1,4-GT 是乳糖合成酶的催化亚基，控制着乳糖合成的效率[24]。刘杰等[25]利用甲珠和蒲公英水煎剂作用于奶牛乳腺上皮细胞，发现甲珠、蒲公英均能明显上调乳腺上皮细胞对乳糖的分泌，并呈一定的剂量依赖效应。马震珠[26]也发现一定剂量的通草、冬葵子和王不留行能提高奶山羊奶样中乳糖的含量。本研究利用漏芦乙醇提取物体外作用奶山羊乳腺上皮细胞，检测其对乳腺细胞乳糖合成关键酶HKⅡ和β-1,4-GT 的mRNA 表达的影响，以反映漏芦对乳糖合成的影响，实验结果表明漏芦乙醇提取物能提高HKⅡ和β-1,4-GT的基因表达，初步说明漏芦通过促进乳糖合成关键酶的表达，进而参与调节乳腺细胞乳糖合成代谢。

4 结论

本研究表明，漏芦乙醇提取物能促进奶山羊乳腺上皮细胞合成分泌β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖；漏芦乙醇提取物能提高乳腺上皮细胞乳成分合成代谢相关酶和蛋白的基因表达，进而影响奶山羊乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。