饲料中预添加不同水平牛磺酸对热应激虹鳟血清生化指标的影响

■罗志成 康玉军 刘 哲* 权金强 秦 勇

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州730070；2.甘肃省渔业技术推广总站，甘肃兰州730070）

虹鳟(Oncorhynchus mykiss)，属硬骨鱼纲(Osteich⁃thyes)，鲑形目(Salmoniformes)，鲑科(Salmonidae)，适宜生长水温为12～18 ℃[1]，是一种冷水性鱼类。其对温度变化具有一定耐受能力，超过范围将造成鱼体损伤甚至死亡[2]。研究表明高温应激对水产动物的生长、发育、摄食以及代谢等方面影响较大[3]。目前，关于虹鳟热应激研究已较为普遍，大量研究表明热应激前后虹鳟血清及组织中抗氧化指标、抗损伤指标及热应激相关蛋白表达差异显著[4]。本课题组发现24 ℃是虹鳟热应激的“一个关键高温点”，该温度点可能是虹鳟由适应性调节进入“受损”的临界点[5-6]；25 ℃时虹鳟肝脏等组织损伤已较为严重[7]。目前关于如何提高虹鳟抗热应激的能力，已成为广大研究人员的重大课题。

牛磺酸，即2-氨基乙磺酸，是动物体内含量最为丰富的非蛋白游离氨基酸，广泛存在于动物各个组织和重要器官中[8]。1827 年首次从公牛胆汁中分离出来，具有广泛的生理功能，如维持内环境稳态，提高机体抗氧化能力和免疫能力，抗细胞凋亡等[9]。目前关于牛磺酸在动物生产中的研究已较为广泛，研究发现，添加外源牛磺酸对水产动物的生长性能、抗氧化能力、非特异性免疫能力具有一定的提升作用[10-11]，且在畜禽动物上研究发现，外源牛磺酸具有改善热应激肉鸡(Gallus gallus domesticus)肠道免疫性能、减轻和保护热应激引发的输卵管损伤[12-13]，但目前关于牛磺酸在虹鳟上的研究鲜见报道。鉴于此，本试验选择牛磺酸作为添加剂，在18 ℃条件下提前投喂不同水平的牛磺酸饲料，30 d 后进行慢性高温应激试验，比较分析高温应激后虹鳟血清生化指标的变化规律，为研制虹鳟抗热应激添加剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

选用北京汉业科技有限公司市售商品化虹鳟膨化浮性颗粒饲料为基础饲料，其主要成分包括鱼粉、豆粕、小麦粉、玉米蛋白粉、鱼油、复合维生素、复合微量元素等，其营养成分含量：粗蛋白(40.0%)、粗脂肪(12.0%)、粗灰分(14.0%)、粗纤维(5.0%)、赖氨酸(2.2%)、水分(12.0%)、总磷(0.9%)，基础饲料营养成分含量由北京汉业科技有限公司提供。将基础饲料粉碎过40 目筛，采用逐级扩大混合法分别在基础饲料中添加0、600.0 mg/kg 和1 200.0 mg/kg 牛磺酸(北京奥博星，含量≥98.0%)，充分混合后制成2 mm 颗粒料，自然晾干后保存备用。

1.2 试验设计与饲养管理

虹鳟由甘肃省张掖市冷水鱼良种繁育中心提供，挑选个体均匀、健康无伤虹鳟450 尾，初始体重为(203.26±2.01) g，随机分成3 组，每个试验组设3 个重复，每个重复投放50 尾，分别饲养在大小一致的养殖槽(250 cm×120 cm×100 cm)中，试验在甘肃省张掖市冷水鱼良种繁育中心进行。所选试验鱼先用基础饲料在18 ℃条件下暂养1 周，然后分别投喂不同水平的牛磺酸饲料，投喂量为虹鳟体重的3%，分别在8:00、14:00 和19:00 进行投喂，每次投喂完成30 min 后，观察摄食情况并统计残饵量，最后用虹吸管吸取每缸粪便，避免水质污染，饲养期间光照周期12 h 光照/12 h 黑暗，试验水为地下微流水(单位面积注水量0.1 m3/m2·h，平均水交换率为0.17 次/h)。每日进行常规的水质指标监测：溶氧量(9.5±0.5) mg/l，氨氮浓度(0.10±0.05) mg/l，水温利用深圳市安晟电子有限公司生产的数显温度计(CX-WDJ200LCD)测量，溶氧量和氨氮浓度利用杭州陆恒生物有限公司溶解氧检测试剂盒和氨氮检测试剂盒测定。18 ℃条件下饲养30 d 后进行高温胁迫试验。模拟自然升温的方法，利用锅炉和加热棒进行升温，使养殖槽的水温从18 ℃开始缓慢上升，严格控制水温使每日升高1 ℃，7 d 后养殖槽水温达到25 ℃。期间光照周期12 h 光照/12 h 黑暗。每日进行常规的水质指标监测：溶氧量(9.5±0.5) mg/l，氨氮浓度(0.15±0.05) mg/l。

1.3 样品采集

试验鱼在24、25 ℃条件下24 h后采样。每组随机挑选3尾，快速转入MS-222(50 mg/l)中深度麻醉，尾静脉采血，血液置于4 ℃静置2 h，于4 ℃、3 000 r/min离心10 min 制备血清，收集血清用液氮速冻，并置于超低温冰箱(-80 ℃)保存备用。

1.4 生化指标测定

取每组血清样品各3 份，按照白蛋白(albumin，ALB)试剂盒(A028-1)、总蛋白(total protein，TP)试剂盒(A045-3)操作说明书测定ALB 和TP 含量，按照总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)试剂盒(A001-1)、过氧化氢酶(catalase，CAT)试剂盒(A007-1)、丙 二 醛(malondialdehyde，MDA)试 剂 盒(A003-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxi⁃dase，GSH-Px)试剂盒(A005)、谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，AST)试剂盒(C010-1)、溶菌酶(lysozyme，LZM)试剂盒(A050)操作说明测定T-SOD、CAT、MDA、GSH-Px、AST、LZM 活性[球蛋白(globu⁃lin，GLO)含量(g/l)=TP 含量-ALB 含量]。所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，其中吸光度值利用紫外/可见分光光度计(UNICO UV-3802)测定，计算并统计数据。

1.5 数据统计与分析

试验数据均使用SPSS Statistics 19.0 中One-way ANOVA和Duncan's法进行单因素方差分析和多重比较。数据结果以“平均值±标准差”(X±SD)表示，n=3，P＜0.05为显著水平。

2 结果与分析

2.1 预添加不同水平牛磺酸对热应激条件下虹鳟抗氧化指标的影响（见表1）

表1 预添加不同水平牛磺酸对热应激条件下虹鳟抗氧化指标的影响

热应激条件下虹鳟血清中抗氧化酶活性随预添加牛磺酸水平变化规律如表1 所示，同一温度点下，虹鳟血清中T-SOD、CAT、GSH-Px 活性随牛磺酸浓度的增加呈现先增大后趋于稳定的变化趋势。24 ℃时，1 200.0 mg/kg 牛磺酸组虹鳟血清中T-SOD、CAT、GSH-Px 活性高于其他组，相比于0 mg/kg 组，酶活性分别增加了32.44%、12.36%、30.84%，差异显著(P＜0.05)；25 ℃时，1 200.0 mg/kg牛磺酸组虹鳟血清中CAT、GSH-Px 活性高于其他组，相比于0 mg/kg 组，酶活分别增加了13.79%、27.96%，差异显著(P＜0.05)。

2.2 预添加不同水平牛磺酸对热应激条件下虹鳟血清蛋白含量的影响（见图1）

图1 预添加不同水平牛磺酸对热应激条件下虹鳟血清蛋白含量的影响

热应激条件下虹鳟血清蛋白含量随预添加牛磺酸水平变化规律如图1 所示，同一温度点下，牛磺酸添加组虹鳟血清中TP、ALB 含量均显著升高(P＜0.05)。24 ℃时，600.0 mg/kg 和1 200.0 mg/kg 牛磺酸组虹鳟血清中ALB含量相比于0 mg/kg组分别提高了18.91%、10.52%，差异显著(P＜0.05)，TP 含量相比于0 mg/kg 组分别提高了10.57%、6.17%，差异显著(P＜0.05)。25 ℃时，600.0 mg/kg 和1 200.0 mg/kg 牛磺酸组虹鳟血清中ALB 含量相比于0 mg/kg 组分别提高了13.39%、16.13%，差异显著(P＜0.05)，TP 含量相比于0 mg/kg 组分别提高了9.13%、11.02%，差异显著(P＜0.05)。

2.3 预添加不同水平牛磺酸对热应激条件下虹鳟血清其它血清酶活性的影响(见图2、图3)

热应激条件下虹鳟血清中LZM 活性随预添加牛磺酸水平变化规律如图2 所示，同一温度点下，虹鳟血清中LZM 活性随牛磺酸浓度的增加呈现逐渐增大的变化趋势。24 ℃时，600.0、1 200.0 mg/kg牛磺酸组虹鳟血清中LZM 活性相比于0 mg/kg 组分别增加了6.41%、7.45%(P＞0.05)；25 ℃时，600.0、1 200.0 mg/kg牛磺酸组虹鳟血清中LZM活性相比于0 mg/kg组分别增加了8.43%、11.35%(P＞0.05)。

图2 预添加不同水平牛磺酸对热应激条件下虹鳟LZM活性的影响

图3 预添加不同水平牛磺酸对热应激条件下虹鳟AST活性的影响

热应激条件下虹鳟血清中AST 活性随预添加牛磺酸水平变化规律如图3 所示，相比于未添加组，添加了牛磺酸的虹鳟在水温达到24 ℃和25 ℃时谷草转氨酶活性均有所降低，且差异显著。24 ℃时，600.0、1 200.0 mg/kg 牛磺酸组虹鳟血清中AST 活性相比于0 mg/kg 组 分 别 降 低 了19.54%、30.15%(P＜0.05)；25 ℃时，600.0、1 200.0 mg/kg 牛磺酸组虹鳟血清中AST 活性相比于0 mg/kg 组分别降低了18.82%、24.13%(P＜0.05)。

3 讨论

3.1 预添加不同水平牛磺酸对热应激条件下虹鳟抗氧化能力的影响

虹鳟是典型的冷水性鱼类，对高温环境异常敏感，其生长和代谢活动极易受到高温的影响。大量研究表明热应激前后，机体抗氧化指标、激素指标、非特异性免疫指标等均会发生较大变化[14-15]。与机体抗氧化能力相关的酶主要包括T-SOD、CAT、GSH-Px 等，其活性和含量的高低直接反映了机体抗氧化能力的强弱[16]。

T-SOD 是动物体内普遍存在的一种金属抗氧化酶(Mn-SOD、CuZn-SOD)，可催化超氧阴离子发生歧化反应生成过氧化氢(H2O2)和水，从而消除异常代谢过程中产生的超氧阴离子[17]。本研究发现，24 ℃时牛磺酸添加组虹鳟血清中T-SOD活性显著高于0 mg/kg组，说明在饲料中添加适量的牛磺酸对虹鳟体内TSOD的合成具有较好的调节作用，这种改善可能与牛磺酸参与合成体内多种调节酶有关，具体调节机制还需进一步深入研究。向枭等[18]研究发现在饲料中添加800.0 mg/kg的牛磺酸，鲤鱼(Cyprinus carpio)SOD活性显著提升。王清滨[19]研究发现在饲料中添加1 200.0 mg/kg 的牛磺酸，草鱼(Ctenopharyngodon idel⁃lus)SOD活性显著提高。说明不同动物牛磺酸适宜剂量存在差异，这可能与试验动物的种类、个体规格不同有关。

CAT 是生物体内的非常重要的抗氧化防御性功能酶，可有效清除T-SOD 歧化超氧阴离子时产生的H2O2，并防止H2O2反应生成有害的羟自由基，较高的CAT 活性代表了机体具有较强的H2O2清除能力。本研究发现，同一温度点下，1 200.0 mg/kg 牛磺酸添加组虹鳟血清中CAT 活性显著高于0 mg/kg组，说明在饲料中添加适量的牛磺酸可有效提升虹鳟血清中CAT 活性。类似规律王清滨[19]在草鱼的研究中同样被发现，说明适量的牛磺酸能提高水产动物消除H2O2的能力，可能是因为牛磺酸参与虹鳟抗氧化相关酶的关键反应，加速了机体对抗氧化酶的合成能力。

GSH-Px 是机体抗氧化酶系统中一种较为重要的分解H2O2的酶，能将有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，从而保护动物机体免受自由基的干扰和损伤。胡金宇等[20]研究发现400.0 mg/kg 的牛磺酸可显著提升小鼠(Mus musculus)血清和组织中GSH-Px 活性。本研究发现，同一温度点下牛磺酸添加组虹鳟血清中GSH-Px 活性显著高于0 mg/kg 组，说明在饲料中添加适量的牛磺酸可有效提升虹鳟血清中GSH-Px 活性，可能是因为外源牛磺酸的摄入，对机体抗氧化系统酶的合成与分泌能力具有促进作用。

MDA 是自由基引发的脂质过氧化反应的最终分解产物，具有细胞毒性，其含量的多少可以间接反映自由基含量的多少以及组织细胞脂质过氧化的程度。本课题组前期研究发现24 ℃水温已对虹鳟机体产生损伤，且通过对相关血清生化指标的分析发现，该温度条件下血清中MDA 含量相较于18 ℃显著提高。本研究中发现，热应激条件下各牛磺酸组虹鳟血清中MDA 含量虽无显著差异，但牛磺酸添加组虹鳟血清中MDA 含量均低于0 mg/kg组，说明预添加牛磺酸对虹鳟肝脏等组织的抗氧化能力起到一定的提升作用，可能是因为牛磺酸具有稳定细胞膜脂质成分的能力，其具体作用机理还需进一步深入研究。

3.2 预添加不同水平牛磺酸对热应激条件下虹鳟血清蛋白含量的影响

血清中TP 由ALB 和GLO 组成，其含量反映了机体代谢和营养状况[21]。ALB是血液中含量最多、功能较复杂的一种蛋白，能平衡机体渗透压，对维持机体正常的生理功能具有重要意义；GLO 的含量影响机体免疫状态，同时对脂类物质的运输也有一定的影响[22]。本研究发现同一温度下，牛磺酸添加组虹鳟血清中ALB 和TP 含量显著高于0 mg/kg 组，说明牛磺酸对虹鳟体内蛋白质的吸收和合成具有较好的调节作用，原因可能是牛磺酸参与机体对蛋白质合成路径中相关反应，通过一定的调节作用从而提高虹鳟血清中ALB 和TP 的含量，其具体调节机制还需进一步研究。

3.3 预添加不同水平牛磺酸对热应激条件下虹鳟其它血清酶的影响

鱼类血液的生化指标与机体的代谢、健康状况密切相关；当鱼类生理状态良好时，生化指标相对稳定；但当鱼体受到外界因素刺激时，生化指标便会发生相应的变化；因此，鱼类生化指标可以为了解鱼体健康状况提供重要参考。LZM是一种碱性蛋白水解酶，能消灭革兰氏阳性菌，主要存在于中性粒细胞、单核细胞和吞噬细胞中，是鱼类非特异性免疫系统的重要组成部分[23]。目前，许多研究水产动物的非特异性免疫功能时常用血清LZM活性表示，LZM 活性提高，其免疫能力也相应提高[24]。本研究发现热应激条件下，牛磺酸添加组虹鳟血清中LZM 活性高于0 mg/kg 组，说明适量的牛磺酸能提高虹鳟血清中LZM的活性，对虹鳟的部分非特异性免疫能力具有提升作用；同时还发现25 ℃时虹鳟血清中LZM活性显著低于24 ℃，说明25 ℃已超过虹鳟自身的耐受能力，机体相关免疫器官已遭受严重的应激损伤，该结果与本课题组前期研究结果一致。

AST是催化α-酮戊二酸反应的一种酶，在正常情况下这种酶主要存在于肝脏和肾脏等组织中，血清中的含量非常少，当组织受损时有大量的转氨酶逸入血液，导致血液中转氨酶活性升高，因此可以根据血清中AST 的活性来判断组织是否受到损伤。本研究发现，热应激条件下牛磺酸添加组虹鳟血清中AST活性相较于0 mg/kg 组均有所降低，说明适量的牛磺酸对水产动物的抗损伤能力具有一定的提升作用。

4 小结

本研究发现热应激条件下，预添加1 200.0 mg/kg的牛磺酸组虹鳟抗氧化能力、部分非特异性免疫及抗损伤能力均高于未添加组，说明牛磺酸能提高虹鳟机体的抗热应激能力，可作为虹鳟抗热应激的备选添加剂，其最适剂量及作用机理有待进一步深入研究。