基于线粒体DNA D-loop 区序列分析中国及新西兰奶山羊遗传进化关系

苏少锋，孟子琪，王 超，赵俊利，郝宸昉，赵启南

（内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

相对于细胞核内遗传物质，线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA） 是动物体内唯一存在的核外遗传物质。 mtDNA 分子量较小，含量相当于核DNA 的1%～2%，长度为15～20 kb，含量和长度远小于核基因组［1-2］。 mtDNA 为母系遗传，由环状的重链（H）和轻链（L）构成，2 条链均参与复制和转录过程［3］。 mtDNA 上的D 环控制区 （D-loop区），是研究物种起源进化和遗传多样性的有效分子标记［4］。 D-loop 区由多个重要元件组成，虽为非编码区，但其是进化速度最快、最具多态性的区域［5］。 D-loop 区已广泛应用于群体遗传多样性及进化发育关系、 核外基因效应及亲缘结构分析等研究领域。利用mtDNA 研究动物的遗传进化关系取得了显著成果。 mtDNA 结构特殊，能以恒定的速度突破物种的限制，在山羊上，特别是在奶山羊的遗传多样性研究中具有一定意义［6-9］。

在国外，Luikart 等［10］研究发现，全世界88 个山羊品种的mtDNA 高变区存在大量变异位点和单倍型，说明山羊群体遗传多样性非常丰富。Saeid等［11］研究表明，山羊mtDNA 存在7 个高度多样化的 单 倍 型。 Kang 等［12］通 过 对 山 羊 完 整 的mtDNA D-loop 分析表明，山羊可以分成4 个明确的谱系，进一步证明了山羊群体遗传多样性丰富。在国内，张红平等［13］利用mtDNA D-loop 区对中国16 个山羊品种的遗传多样性进行研究， 结果表明， 共有41 种单倍型，说明中国家养山羊的遗传多样性较为丰富，部分地方品种具有独特的单倍型。Liu 等［14］对9 个中国山羊品种的mtDNA D-loop 区进行分析，发现中国山羊存在2 种母系来源。侯磊等［15］的研究也发现中国黑山羊群体具有丰富的遗传多样性。在奶山羊的遗传多样性研究方面，皮秀霜［16］对中国奶山羊mtDNA D-loop 区的研究表明，中国奶山羊品种遗传多样性相对贫乏， 培育品种中含有较多的萨能奶山羊血统， 中国奶山羊的遗传多样性不受地域限制；韩浩园等［17］对河南奶山羊遗传资源现状进行研究， 表明河南奶山羊是以萨能奶山羊为父本，河南地方品种为母本杂交选育而成。

羊奶具有营养和保健双重功效， 是当今乳营养保健的最佳选择之一。 羊奶的营养价值越来越受到人们的关注。 中国奶山羊的养殖量居世界前列，主要分布在新疆、内蒙古、陕西、河北、河南、山东、四川等地。 目前，关于中国奶山羊遗传多样性及进化关系的研究报道较少。 笔者以7 个奶山羊品种（崂山奶山羊、文登奶山羊、关中奶山羊、雅安奶山羊、萨能奶山羊、阿尔卑斯奶山羊、吐根堡奶山羊）为研究对象，采用PCR 扩增后直接测序的方法研究中国奶山羊品种和国外引进品种的群体mtDNA D-loop 区全序列多态性，分析不同奶山羊品种的遗传多样性及进化关系， 了解中国奶山羊和国外奶山羊的遗传资源状况， 为加快我国奶山羊育种工作， 以及奶山羊种质资源的长期有效保护和科学开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集

采集7 个奶山羊品种的33 只个体的外周血样本（见表1），包括文登奶山羊（n=5）、关中奶山羊（n=4）、崂山奶山羊（n=7）和雅安奶山羊（n=4）4个中国培育奶山羊品种，以及阿尔卑斯奶山羊（n=5）、吐根堡奶山羊（TGB）、萨能奶山羊（SN）3 个新西兰引进奶山羊品种。选择谱系信息清晰、无亲缘关系的个体采样，每个个体均代表一个母系群体，满足样本量最小需求。 静脉采血， 放置在加有EDTA 抗凝剂的真空采血管中，-20 ℃冰箱保存。

表1 7 个品种奶山羊信息 单位：只

1.2 基因组提取及PCR 扩增

采用血液基因组DNA 提取试剂盒提取血样基因组DNA。 PCR 引物以山羊线粒体参考基因组（GenBank 登 录 号：NC_005044.2） 中mtDNA Dloop 区全长序列为参考设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（见表2）。

表2 奶山羊mtDNA D-loop 区PCR 引物信息

PCR 反应体系为40 μL：DNA 模板2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，ExTaq mix 20 μL，ddH2O 14 μL；反应程序为：95 ℃5 min；95 ℃10 s，58 ℃10 s，72 ℃90 s，35 个循环；72 ℃10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖电泳检测， 确认正确后，直接送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.3 数据分析

测序结果文件使用LaserGene 软件的SeqMan模块进行拼接， 拼接序列使用ClustalW 软件进行全局比对， 确定种属关系并分析各品种组内以及组间遗传距离；然后使用MEGA 7.0 软件［18］，以邻接法构建系统发育树，1 000 个自举检验（Bootstrap） 重复评估系统发育树的稳定性并计算品种间的相关遗传距离。 将比对后的FASTA 文件导入DnaSP V 5［19］软件，对7 个奶山羊品种的mtDNA D-loop 区进行遗传多样性分析以及品种间基因流和遗传分化分析。 利用DnaSP V 5 软件生成单倍型数据，导入NETWORK 10.2.0.0 软件构建单倍型网络图并分析其频率分布。

2 结果与分析

2.1 奶山羊mtDNA D-loop 区全序列的PCR 扩增及检测

奶山羊血液样本提取基因组DNA 后进行PCR 扩增。 PCR 扩增结果（见图1）显示，扩增条带清晰且明亮，无明显杂带，大小约1 200 bp，与预期大小一致， 可用于后续试验。 扩增产物经过回收、纯化处理，进行Sanger 测序。

2.2 奶山羊mtDNA D-loop 区全序列分析

测序拼接和截切后， 经ClustalX 软件进行序列同源性比对， 用MAGE 7.0 软件对D-loop 区全序列进行核苷酸组成分析，结果表明，4 种核苷酸T、C、A、G 的 平 均 比 例 分 别 为30.9%、14.4%、28.7%、26.1%，A+T 含量（59.60%）高于G+C 含量（40.50%），说明奶山羊mtDNA D-loop 区富含A、T 碱基，显示出哺乳动物线粒体DNA 碱基组成偏倚性的基本特征。 对奶山羊样本的mtDNA D-loop区序列碱基变异位置进行分析，结果表明，奶山羊的mtDNA D-loop 区全序列碱基变异位点分布不均匀，250～500 bp 区段比较保守，500～650 bp 区段变异最为丰富，650～1 000 bp 区段变异较弱，550～650 bp 区段变异率达到最高 （见图2A）；mtDNA D-loop 区左功能区为保守区域，中间为高变区域。核苷酸多样度分布检测结果显示，250～500 bp 区段碱基较保守，500～600 bp 区段核苷酸多样度较高，608 bp 左右核苷酸多样度的值最大，650～1 000 bp 区段核苷酸多样度较弱（见图2B），该结果与碱基变异分布变化趋势一致。

2.3 奶山羊mtDNA D-loop 区序列的SNPs 分析

使用DNASP 5.10 软件对33 只奶山羊mtDNA D-loop 区的序列进行分析， 检测到82 个多态位点，占检测核苷酸总量的7.41%，说明该序列突变率较大， 稳定性较差。 有25 个单一多态位点（singleton variable sites）， 占 总 多 态 位 点 数 的30.48%， 分 别 位 于158、183、476、542、569、585、650、651、702、736、759、763、790、814、862、959、962、963、964、972、973、1 007、1 112、1 170、1 174 bp处。 有55 个简约信息位点（parsimony informative sites），占总多态位点数的64.63%，其中，有53 个2 种变异型， 分别位于13、14、103、126、133、141、160、178、258、320、391、540、578、580、581、583、586、596、604、612、613、614、617、631、640、641、642、643、646、647、648、649、654、658、673、676、703、710、712、727、730、750、780、788、812、816、869、878、899、1 004、1 012、1 100、1 173 bp 处； 有2 个3 种变异型，分别位于693、1 177 bp 处。

2.4 奶山羊mtDNA D-loop 区单倍型多样性分析

使用DNASP 5.10 软件对奶山羊mtDNA Dloop 区的序列进行检测，7 个奶山羊品种的总单倍型多样度（haplotype diversity，Hd）为0.980，各品种单倍型多样度范围为0.905～1.000；总核苷酸多样度（nucleotide diversity，Pi）为0.014 42，各品种核苷酸多样度的范围为0.001 51～0.013 32， 文登奶山羊的单倍型多样度和核苷酸多样度最高， 表现出较丰富的遗传多样性， 而崂山奶山羊的遗传多样性较单一。 单倍型分析共发现26 个单倍型（Hap1～Hap26，见表3），其中，文登奶山羊和萨能奶山羊各有5 个单倍型， 分别为Hap19～23 和Hap5～9；阿尔卑斯奶山羊有4 个单倍型，为Hap1～4；崂山奶山羊、吐根堡奶山羊、关中奶山羊、雅安奶 山 羊 各 有3 个 单 倍 型， 分 别 为Hap10 ～12、Hap16～18、Hap13～15、Hap24～26。单倍型系统发育树和单倍型网络图可以分出5 个单倍型组， 崂山奶山羊和文登奶山羊聚在一起； 关中奶山羊和阿尔卑斯奶山羊聚在一起； 其他3 个品种分别单独聚为一组（见图3、图4）。 6 个品种奶山羊的Tajima′s D 中性进化检验均不显著（P>0.10），符合平衡发展趋势， 说明群体未出现大规模扩张或瓶颈现象，群体大小始终保持在相对稳定的状态（见表3）。 利用MEGA 7.0 软件中的Kimura2-parameter模型，以邻接法NJ 构建系统发育树，并对拓扑图进行了自展检验（Bootstrap），重复抽样次数为1 000 次。 结果表明，26 种单倍型被聚类成5 个分支，萨能奶山羊属于2 个分支上。

表3 奶山羊品种的遗传多样度及单倍型

2.5 遗传分化及基因流分析

7 个奶山羊品种间相关分析结果 （见表4）表明， 核苷酸平均差异数 （KXY） 范围在6.400 00～38.450 00，核苷酸歧异度（DXY）范围在0.005 79～0.034 76；阿尔卑斯奶山羊与萨能奶山羊的KXY和DXY最低， 文登奶山羊和雅安奶山羊的KXY和KXY最高；遗传分化系数（GST）范围为0.000 00～0.186 05，遗传分化指数（FST）范围为0.231 56～0.971 52，7 个奶山羊品种的FST均大于0.150 000，说明群体间存在较大的遗传分化，其中，崂山奶山羊与雅安奶山羊的FST最高，说明2 个群体存在很大的遗传分化。

表4 遗传分化及基因流分析相关参数

2.6 系统发育树构建与遗传距离分析

系统发育树分析结果与单倍型网络关系分析一致。 7 个奶山羊品种间遗传距离（见表5）表明，在引进品种中， 萨能奶山羊与阿尔卑斯奶山羊和吐根堡奶山羊的遗传距离相近，分别为0.012 2 和0.015 5；在培育品种中，崂山奶山羊与文登奶山羊聚为一支，遗传距离为0.008 0。 地方品种雅安奶山羊与其他品种遗传距离最远。 关中奶山羊与国外奶山羊遗传距离较近， 符合关中奶山羊来源于国外奶山羊的杂交历史。系统发育树NJ 聚类图同样证明了该结果（见图5）。

表5 奶山羊群体间平均遗传距离参数

3 讨论

3.1 奶山羊的遗传多样性

研究表明， 山羊mtDNA D-loop 区位于tRNA pro 和t RNA phe 之间， 长度在1 120 bp 左右［20］。在该研究中，7 个品种奶山羊的mtDNA D-loop 区长度为1 213～1 215 bp，与前人研究一致，插入或缺失碱基导致品种间存在少数碱基的差异； 奶山羊的mtDNA D-loop 区全序列碱基变异位点分布不均匀， 核苷酸位置及突变率与前人研究结果相似，说明该研究中奶山羊mtDNA 的遗传多样性结果可信［13，21-22］；mtDNA D-loop 区中A、T 碱基含量高于G、C 碱基含量， 证明奶山羊mtDNA D-loop区序列存在碱基偏倚性， 符合哺乳动物线粒体mtDNA 碱基组成偏倚性的特征。

单倍型多样度和核苷酸多样度可以衡量群体遗传分化程度， 与群体遗传性呈正相关。 该研究中，7 个品种奶山羊mtDNA D-loop 区的单倍型多样度为0.980，核苷酸多样度为0.014 42，说明奶山羊品种的总体核苷酸多样性与核苷酸多样性均较高，提示奶山羊的遗传多样性比较丰富；关中奶山羊、 崂山奶山羊和雅安奶山羊的核苷酸多样度较低， 关中奶山羊和崂山奶山羊的研究结果与前人研究结果一致［9，23-24］，表明关中奶山羊、崂山奶山羊和雅安奶山羊的遗传多样性较为贫乏， 该结果可能与分析的序列相关。 有学者以mtDNA 的HVI 片段为研究序列，而笔者以mtDNA D-loop 区全序列为研究对象进行分析。此外，这三个品种可能均以萨能奶山羊为亲本， 长期与地方品种进行杂交改良和选育而成，血统来源途径相对单一。

遗传分化指数反映遗传分化程度，普遍认为在0.25～1 为高度遗传分化［25-26］。该研究中，7 个品种奶山羊的遗传分化指数范围为0.231 56～0.971 52，表明品种之间存在较高水平的遗传分化， 文登奶山羊和吐根堡奶山羊的分化系数最低， 说明文登奶山羊可能在后期演变过程中存在吐根堡奶山羊的基因渗入。

3.2 奶山羊mtDNA D－loop 区系统发育分析

该研究的系统发育分析表明， 中国奶山羊mtDNA D-loop 区序列由明显的2 个进化系组成，说明中国奶山羊种群有2 个母系起源， 这与其他学 者 对 中 国 山 羊 的 研 究 结 果 一 致［14，16，27-28］；其 中，支系与国外品种遗传距离很近， 说明中国奶山羊是国外引进品种培育而成，含本地山羊血缘较少。文登奶山羊与崂山奶山羊在系统发育树中关系紧密， 这是因为2 个品种都产自中国山东省， 均由1898—1934 年从德国与俄罗斯引入的萨能奶山羊与当地山羊品种杂交培育形成［29-30］；关中奶山羊是我国分布最广、推广范围最大的奶山羊品种，该品种起源于20 世纪30 年代， 由西方传教士带入少量萨能奶山羊和吐根堡奶山羊， 并在中原地区与地方山羊杂交而成，因此，关中奶山羊与国外引进品种的亲缘关系较近［31］。 雅安奶山羊在系统发育树中独立成一支。 雅安奶山羊分布在我国四川盆地，虽然最早也是国外引进品种培育的，但后期再没有进行大规模的引进及导血， 选育工作也在20 世纪80 年代末中断， 导致雅安奶山羊群体数量锐减， 再加上长期的地理结构影响和历史原因，与其他地方品种少有杂交，存在较为单一的遗传背景［32］。

3.3 奶山羊群体扩张分析

群体扩张及进化历史可影响mtDNA 的遗传变异模式和遗传多样性，饲养环境的强烈改变，可显著改变家养动物群体的随机漂变和等位基因频率，因此，当群体数量骤减或骤增时，检测是否发生过群体扩张具有必要性。 该研究中所有奶山羊品种的Tajima′s D 值为负数，P>0.10，无显著差异，表明奶山羊未出现较大规模的群体扩张。

该研究采集的样本可能无法代表整个奶山羊品种群体的遗传分化情况，但是在目前，关于奶山羊遗传多样性的研究报道较少， 该研究获得的结果可为今后研究奶山羊群体遗传结构提供参考。在后期研究中，通过增加奶山羊种类及个体数量，剔除遗传背景复杂的样本， 可有效降低遗传进化分析误差， 进一步明晰中国奶山羊和国外奶山羊的遗传多样性及进化关系， 为奶山羊新品种选育提供理论基础。

4 结论

利用mtDNA D-loop 区对7 个奶山羊品种的遗传多样性进行研究， 发现中国奶山羊存在2 个支系起源且未发现群体扩张； 中国培育奶山羊品种含有较多的国外奶山羊血统； 文登奶山羊与崂山奶山羊亲缘关系较近， 雅安奶山羊在遗传进化中可能存在地域隔离。