猪毛蒿醇提物最佳提取工艺条件研究

郭晨阳，刘嘉琳，钟华晨，王丽芳

［1.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（呼和浩特），内蒙古 呼和浩特 010031；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031］

猪毛蒿（Artemisia scoparia）是菊科蒿属多年 生草本植物，主要分布在我国东部、南部的中、低海拔地区的山坡、旷野和路两旁，以及西北省份的中、低海拔至2 800 m 的地区［1］。猪毛蒿不仅分布广泛而且产量高， 单个样地覆盖度可达50%以上［2］。其味苦、辛，微寒，有浓烈的香气。随着对猪毛蒿化学成分、理化性质和生物学功能研究的逐渐深入，发现猪毛蒿全株含挥发油、绿原酸、对-羟基苯乙酮和大黄素等活性成分。 文献报道， 具有广泛抗菌、 抑菌作用的绿原酸对多种致病菌和病毒有较强的抑制和杀灭作用［3-5］，药用价值极高，可镇静、消炎、清热利湿、利胆退黄、升高白细胞及促进胃液分泌，临床用于治疗头晕、头痛及高血压，是降血压的特效中草药［6］，对急性咽喉炎症及皮肤病也有明显疗效［7］。

农业农村部发布的194 号公告指出：“自2020 年1 月1 日起，退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种； 自2020 年7 月1 日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料。 ”194 号公告的发布， 旨在减少畜牧业生产中滥用抗生素对畜产品安全和公共卫生安全造成的危害， 进一步提高动物营养水平，调整饲料营养设计，选用新型绿色添加剂产品，因此，寻找抗生素的替代品成为当前的研究热点。 绿色天然的植物提取物作为一种新型饲料添加剂，具有适口性好，有效成分明确，含量可检测，安全性、稳定性和利用率高，无残留及无毒副作用的特点， 且通过对植物提取物中丰富的生物活性成分进行组合，制备复方制剂，可发挥更确切、 更高效的作用， 是抗生素的理想替代品之一，被广泛应用于动物生产［8］。

植物提取物富含黄酮、多酚、生物碱、皂苷等多种生物活性物质，具有抑制病原微生物、增强免疫功能、提高抗氧化能力、改善机体健康、提升生产性能和畜产品品质等作用［9］。 黄酮是普遍存在于植物中的一种天然抗氧化剂，多具有药物活性，如抗氧化［10］、抑菌［11］和抗炎［12］等作用。生物碱类为药用植物有效成分，具有抗肿瘤［13］、抗菌［14］、镇痛［15］、抗炎［16-17］等功效。多酚具有多个酚基团，有抗氧化［18］、抗菌［19］、促进肠胃消化、降低血脂以及提高身体抵抗力等多种生物活性作用。 皂苷是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，具有解热、镇静、抗癌及抗菌等有价值的生物活性［20］。 植物提取物的提取工艺在较大程度上决定了提取物产品生物活性成分的占比及作用。 提取植物有效成分常用的方法有索式抽提法、回流提取法、摇床振荡醇提法、超声提取法、渗漉法等［21］。

该研究选用生物活性物质含量丰富、药用价值高、提取方法多样且在内蒙古地区生长茂盛的一年生菊科植物——猪毛蒿为试验材料， 采用冷凝管回流提取法，以乙醇为萃取溶剂，通过单因素筛选及正交试验优化，以提取物得率为评价指标，确定猪毛蒿生物活性物质醇提最佳提取工艺条件，以期为开展猪毛蒿有效成分研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 全株猪毛蒿样本

在系统动物营养学——营养活性物质组学［22］的指导下，选择菊科植物猪毛蒿作为试验材料。全株猪毛蒿样本于2020 年8 月采自内蒙古自治区鄂尔多斯市鄂托克前旗。

1.1.2 仪器与耗材

粉碎机（Retsch SM100）、旋转蒸发仪（EYELA OSB-2100）、冻干机（LGJ-10FD 松源冻干）、电子天平（METTLER TOLEDO）、圆底蒸馏瓶（1 000 mL）、烧杯（500 mL）、冷凝管、蝴蝶夹、纱布（400 目）、玻璃培养皿、锡纸、自封袋等。

1.2 试验方法

1.2.1 提取方法

采用冷凝管回流提取法，以易挥发的乙醇作为提取溶剂，将浸出液水浴加热蒸馏，乙醇溶剂馏出后又被冷却， 重复流回圆底烧瓶浸提原料，直至有效成分回流提取完全［23］。 按中医药学处理中药药材的方法，将全株猪毛蒿置于阴凉通风处干燥后切成10～15 mm 长的小段进行粉碎。 称取猪毛蒿粉末10 g 装入1 000 mL 圆底蒸馏瓶，加入不同浓度乙醇，设定不同料液比、提取温度和提取时间进行回流提取。 提取液用400 目纱布进行初步过滤。每次试验回流提取3 次，将3 次提取液混合后的滤液用旋转蒸发仪进行浓缩， 再将浓缩液进行冷冻干燥，对得到的提取物进行称重，计算得率。

1.2.2 单因素试验

假定该研究中各单因素没有交互作用，对其中的一个因素进行试验，将其他因素固定。 在筛选料液比因素时，固定乙醇浓度65%，提取温度75 ℃，提取时间2.5 h；在筛选不同乙醇浓度时，固定料液比1∶8，提取温度75 ℃，提取时间2.5 h；在筛选不同提取温度时，固定乙醇浓度65%，料液比1∶8，提取时间2.5 h；在筛选不同提取时间时，固定乙醇浓度65%，料液比1∶8，提取温度75℃。

1.2.3 正交试验

在单因素试验的基础上， 以提取物得率为指标，开展以乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间为四因素三水平的L9（34）正交试验，试验设计见表1。提取物得率=所得提取物质量/所用植物粉末质量×100%。

表1 L9（34）正交试验设计

1.3 数据统计与分析

采用Excel 软件进行原始数据处理， 利用SPSS 25.0 软件对数据进行统计学检验，通过方差分析比较不同数据组间的差异，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著，P＞0.05 为差异不显著，应用GraphPad 8.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同提取工艺条件对猪毛蒿提取物得率的影响

从图1 乙醇浓度对猪毛蒿提取物得率的影响、图2 料液比对猪毛蒿提取物得率的影响、图3提取时间对猪毛蒿提取物得率的影响、 图4 提取温度对猪毛蒿提取物得率的影响， 以及表2 不同提取工艺条件对提取物得率的影响可以看出，乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度等不同影响因素对猪毛蒿提取物得率的影响均较大。 单因素乙醇浓度为50%时提取物得率最高，1、2、3 组得率分别为19.6%、19.8%、15.0%， 平均值18.13%；单因素料液比1∶7 时得率最高，1、5、8 组得率分别为19.6%、21.0%、11.0%，平均值17.2%；单因素提取时间3.0 h 时得率最高，3、5、9 组得率分别为15.0%、21.0%、17.5%，平均值17.83%；单因素提取温 度75 ℃时 得 率 最 高，2、5、7 组 得 率 分 别 为19.8%、21.0%、18.1%，平均值19.63%。

表2 不同提取工艺条件对提取物得率的影响

2.2 不同工艺条件对极差R 值的影响

从表3 可以看出，比较各因素极差R 值，影响猪毛蒿醇提物得率的主要因素是乙醇浓度； 提取温度、提取时间和料液比是次要影响因素；它们的主次顺序是：提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比。 由表3 可知，由正交试验优化的最优组合为A2B1C3D2，即猪毛蒿醇提物有效成分最佳提取工艺条件是：乙醇浓度65%，料液比1∶7，提取时间3.0 h，提取温度75 ℃，在该条件下猪毛蒿醇提物的得率最高。

表3 不同工艺条件对极差R 值的影响

2.3不同工艺条件的方差分析结果

方差分析结果表明（见表4），提取温度对猪毛蒿醇提物得率影响差异极显著（P＜0.01），乙醇浓度、料液比、提取时间3 个因素对提取物得率影响差异不显著（P＞0.05）。

表4 方差分析结果

3 讨论

由不同影响因素组合成的不同提取工艺会提取出植物中不同的活性成分。 而在最佳提取工艺条件的确定中，由于同一因素在不同条件下会影响植物提取物得率，同时，不同因素在各自不同条件下会对提取物得率产生交互作用［24］。 在单因素试验中，只能逐步对每个因素进行考查，而将其他因素设为固定。该研究在单因素试验基础上，设计正交试验，以提取物得率为评价指标，通过回流工艺提取猪毛蒿提取物并对工艺条件进行优化。

该研究中，在乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度4 个因素中， 提取温度对猪毛蒿提取物得率影响差异极显著， 是影响猪毛蒿乙醇提取效果的主要因素。研究表明，以不同浓度的乙醇作为萃取溶剂， 对活性成分的溶解能力及细胞结构的影响程度不同［23］。一般来说，乙醇作为萃取溶剂提取出的植物主要生物活性成分有黄酮类［25-27］、多酚类［28］、生物碱类［29］、三萜类化合物［30］等次生代谢产物，包含酮、萜、醚、酚和炔等基团化学结构，较为稳定。而这些有机官能团虽然化学性质不同，但可通过相互作用维持生物体机能［22］。在该研究中，随着乙醇浓度的升高，猪毛蒿提取物得率显著降低，可能的原因是随着乙醇浓度升高，水的比例减少，所得提取物中脂溶性成分多，分子量小，得率低；而65%乙醇浓度可促进乙醇分子和水分子在细胞内外的流动［31］，即此时可将脂溶性成分和水溶性成分都提取出来，且提取物相对分子量较大［32］，提取物得率较高。该研究显示，提取温度对得率的影响是随着温度的上升，得率先增后减，在75 ℃达到最大值，此后大幅下降。可能的原因是随着温度的升高，活性成分的分子扩散速度不断加快，多数物质的溶解度不断增加，得率增大。而乙醇的沸点为78.3 ℃，当提取温度高于此温度时，一些热敏性成分遭到破坏而造成得率下降， 且乙醇会大量挥发，提取成本也大大增加［33］。用乙醇作为萃取溶剂的温度一般为55～60 ℃， 以防止有效成分溶解度降低或失去活性，而若提取温度过高（>90 ℃）就会破坏活性成分的结构［34，2］。在提取猪毛蒿有效成分时，料液比为1∶7 时得率最高，说明此时提取物活性成分已接近全部溶出。 虽然此时得率与料液比为1∶9 时几乎持平， 但出于对节省乙醇溶剂和保护环境的目的选择料液比为1∶7 效果更佳， 这与徐燕燕等［2］对荷叶总黄酮提取工艺优化研究中得到的结果相符。因此，综合考虑生产成本及提取效果，该研究选取较优的提取料液比为1∶7。 随着提取时间的增加，提取物得率增加，在2.5 h 后增加速度加快，在3.0 h 时得率达最大值。 可能的原因是随着提取溶剂和溶质在提取装置中不断回流，增强了提取物分子间的碰撞， 有助于增加提取物得率； 但也有研究表明提取时间过长产物的结构不仅会被破坏， 有些类别的化合物也会随着溶剂的不断蒸发有所损失或降解［35］，从而引起提取量降低。如果提取时间不够，就无法使猪毛蒿中的有效成分充分溶出，造成提取不完全。而提取时间越长，温度越高，得率相对越大［36］。因此，最佳提取时间为3.0 h。

4 结论

在实验室条件下，以乙醇为萃取溶剂，提取物得率为主要指标，通过单因素试验和正交试验，确定猪毛蒿有效成分的最佳提取工艺条件是： 乙醇浓度65%，料液比1∶7，提取温度75 ℃，提取时间3.0 h。 提取温度为主要影响因素，乙醇浓度、料液比、提取时间是次要影响因素；影响提取物得率的主次顺序是：提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞料液比。