副猪嗜血杆菌comC 基因遗传进化及其与菌株血清型和潜在毒力基因的相关性分析

李军星,徐丽华,苏 菲,余 斌,袁秀芳 (浙江省农业科学院 畜牧兽医研究所,浙江 杭州310021)

副猪嗜血杆菌是猪的重要病原菌,能引起以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等为特征的疾病。目前,副猪嗜血杆菌病已成为导致保育猪死亡的重要原因。由于不同分离株在致病力和基因型方面都表现出很强的异质性,因此,区分正常栖生菌株及致病菌株对于该病的诊断和疫苗研究具有重要意义。

目前,已建立了多种副猪嗜血杆菌的菌株分类方法,并尝试建立了菌株分类和菌株致病力之间的关系。血清分型是最常用的分类方法,已发现15种血清型,1,5,12,13,14型等血清型的菌株被认为具有高毒力,但同一血清型内的菌株毒力并不一致[1]。ERIC-PCR 是较常用的副猪嗜血杆菌基因分型方法,但基因型和菌株的临床致病力(分离部位)之间不存在明显关联[2]。基于单个基因的遗传变异分析也被广泛用于副猪嗜血杆菌的种群结构研究,如16S r RNA、hsp60、omp P2等基因,同时发现某些进化树分支上富含高毒力菌株[3-4]。基于完整基因组的遗传进化分析发现,副猪嗜血杆菌毒力菌株在进化树的各个分支上都有分布[5]。因此,副猪嗜血杆菌菌株分类与毒株临床致病力之间的关系仍需要进一步研究。

com ABCDE基因簇参与副猪嗜血杆菌自然感受态调控[6],其中com A对副猪嗜血杆菌的自然感受态的产生至关重要[7],但关于该基因簇的其他基因在副猪嗜血杆菌中的相关研究并不多见。comC基因曾被用于变形链球菌的菌株分类,发现该基因的遗传变异对菌株的自然感受态并无显著性影响[8]。但另一项研究表明comC基因的遗传变异对肺炎链球菌感受态以及生物膜的形成具有一定影响。鉴于生物膜与致病菌在宿主体内的定植过程相关,因此推测该基因的遗传变异可能会影响该菌在宿主体内的持续定植以及在宿主间的传播能力[9]。本研究拟对2009－2017年分离的副猪嗜血杆菌的comC基因进行遗传变异分析,对菌株的临床致病力(分离部位)以及血清型与comC遗传变异的相关性进行分析,并对部分已发现的潜在毒力因子在不同分支中的分布进行检测,以期为阐明副猪嗜血杆菌复杂的种群结构及其与菌株致病力的关系提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株和试剂本研究所用的148个副猪嗜血杆菌临床分离株由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所猪病研究室分离鉴定保存。菌株分离于2009－2017年,病料及病猪来源地为浙江省、安徽省以及江西省。本研究所用菌株包括3个鼻腔分离株、86个肺脏(气管或支气管)分离株、16个胸腔积液分离株、16个心包液分离株、7个腹腔积液分离株、9个关节液分离株、9个脾脏分离株以及2个脑分离株。大豆胰蛋白胨琼脂(TSA)、大豆胰蛋白胨肉汤(TSB)、蛋白胨、酵母提取物等细菌培养基均购自OXOID 公司；DH5α菌株由本实验室保存；PCR 试剂、DNA 胶回收试剂盒及p MD19-T 载体均购自Ta KaRa公司；Tris购自BBI生命科学有限公司；EDTA、NAD 以及蛋白酶K 购自生工生物工程(上海)股份有限公司；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 引物的设计与合成根据GenBank中登录的副猪嗜血杆菌SH0165 菌株的基因组序列(CP001321),设计能扩增全长comC基因的引物,同时设计扩增潜在毒力因子Hsd S的引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其他3个潜在毒力基因fhu A、Hsd R、omp P2 的引物参照文献[10-11]。副猪嗜血杆菌分子血清型鉴定的PCR 方法及引物参照文献[12]。

1.3 副猪嗜血杆菌基因组DNA 提取将－80℃冻存的148 个副猪嗜血杆菌菌株划线接种至含0.025% NAD 及3%新生牛血清的TSA 平板,次日转接至含0.025% NAD 及3%新生牛血清的TSB培养基,培养至D600nm约为0.6。取纯培养副猪嗜血杆菌菌液离心后弃上清,以Tris重悬菌体后,加入6μL 蛋白酶K (20 g/L),56℃水浴45 min；然后100℃水浴20 min,12 000 r/min离心1 min。取上清作为模板,以本研究设计的引物进行comC及hsd S基因的PCR 扩增,以参考文献中的引物进行fhu A、hsd R、omp P2基 因的扩 增[10-11]。

表1 扩增comC 及hsd S 基因的引物

1.4 comC 基因克隆、测序及进化树分析PCR 产物经胶回收纯化后克隆到p MD19-T 载体,转化大肠杆菌DH5α,经PCR 鉴定阳性后,由杭州有康生物科技有限公司测序。采用Lasergene 7软件进行comC基因的遗传进化分析。

图1 148株副猪嗜血杆菌基于comC 基因的进化树

2 结果

2.1 分离的副猪嗜血杆菌comC 基因序列分析

通过对本实验室保存的148株临床分离的副猪嗜血杆菌的comC基因进行PCR 扩增,结果显示所有菌株中都存在comC基因,且所有菌株的该基因长度一致,均为531 bp。基于comC基因的进化树分析表明,副猪嗜血杆菌形成2个相对独立的分支,在分支Ⅰ中又形成2 个亚群Ⅰ-A 和Ⅰ-B(图1)。Ⅰ-A分支中包含56个分离株,占总分离株的37.8%；Ⅰ-B分支包含49个分离株,占总分离株的33.1%；Ⅱ分支中包含43个分离株,占总分离株的29.1%。这表明,副猪嗜血杆菌临床分离株在3个分支中的分布较为均匀,基于comC基因的遗传进化分析对副猪嗜血杆菌临床分离株具有良好的区分能力。

2.2 潜在毒力基因在副猪嗜血杆菌进化树各分支中的分布基于对高毒力和低毒力菌株的对比研究发现,外膜蛋白fhu A及omp P2基因、细菌限制修饰系统相关基因hsd S和hsd R等与菌株的毒力密切相关[10-11]。因此本研究对上述4种潜在毒力因子在148个菌株中的携带情况进行了调查,omp P2基因在所有菌株中都能扩增到,其他3 个毒力基因fhu A、hsd S和hsd R均仅在部分菌株检测到。分支Ⅰ-A、Ⅰ-B和Ⅱ中携带fhu A基因的菌株分别有14,39,6 个,检出频率分别为25.0%,79.6%,14.0%；携带hsd S基因的菌株分别有45,11,9个,检出频率分别为80.4%,22.4%,20.9%；携带hsd R基因的菌株分别有52,19,13 个,检出频率分别为92.9%,38.8%,30.2%。因此,fhu A基因主要分布于Ⅰ-B分支,hsd S和hsd R主要分布于Ⅰ-A 分支,而fhu A、hsd S和hsd R在分支Ⅱ中的检出频率都较低(图2)；这表明,所检测的毒力基因在3个进化树分支Ⅰ-A、Ⅰ-B 和Ⅱ中的分布模式存在明显差异。

图2 4种潜在毒力基因在副猪嗜血杆菌进化树各分支中的分布

2.3 血清型在副猪嗜血杆菌各分支中的分布通过PCR 方法进行血清型检测,结果显示血清4型和12型菌株最多,均为28个,均占总分离株的18.9%；其次为血清13型,共有24个分离株,占总分离株的16.2%；再次为血清5型,共有20个菌株,占总分离株的13.5%。其他血清型占总分离株的比例均低于10%,有4个不能分型菌株,未检测到血清3型及血清15型菌株。分支Ⅰ中的血清4,5,12,13,14型菌株分别为24,18,24,18,13个,占相应血清型分离菌株总数的85.7%,90.0%,85.7%,75.0%,92.9%。分支Ⅱ中血清1,2,7 型菌株的数量分别为6,4,8个,占相应血清型分离菌株总数的75.0%,80.0%,80.0%(图3)。结果表明,血清4,5,12,13,14型菌株主要分布于Ⅰ分支,而血清1,2,7型菌株主要分布于Ⅱ分支,血清型的分布与基于comC基因的遗传进化分析有一定的相关性。

图3 各血清型以及不能分型菌株(Su)在副猪嗜血杆菌进化树分支中的分布

2.4 系统感染分离株在副猪嗜血杆菌各分支中的分布从鼻腔、肺脏(气管或支气管)分离到的菌株称为呼吸道分离株,胸腔积液、心包液、腹腔液、关节、脾脏和脑等感染部位分离到的菌株称为系统感染分离株。3个进化树分支Ⅰ-A、Ⅰ-B、Ⅱ中的系统分离株的比例分别为46.4%,32.7%,39.5%(图4)。肺脏分离株在上述3 个分支中的分布数量较为接近,分别为30,31,25个；而心包液分离株在上述3个分支中的分布差别较大,分别为12,3,1 个(图5)。结果表明,系统感染分离株在3个分支中都有分布,在Ⅰ-A 中的分布要略高于另外2个分支,肺脏分离株在3个分支中的分布相对均衡,而心包液分离株主要分布于Ⅰ-A 分支。

3 讨论

副猪嗜血杆菌在全球主要养猪国家都存在,在我国的流行也非常广泛。由于副猪嗜血杆菌菌株间的致病力差异较大,研究人员建立了多糖、基因及蛋白质水平的多种菌株分类方法,并探索了不同的菌株分类方法与菌株致病力的关系,以期建立较为简便的致病菌株与非致病菌株的区分办法。HOWELL等[5]基于212个副猪嗜血杆菌菌株基因组水平的序列分析显示,该菌可以分为两个主要的进化树分支,毒力菌株在进化树上的每个分支都有分布,但部分血清型在两个分支中的分布有明显区别,如血清5,12,13型菌株主要分布于分支Ⅰ,而血清7型菌株主要分布于分支Ⅱ。本研究发现基于comC的遗传进化分析可将所用菌株分成相对独立的2个大群,血清4,5,12,13,14 型菌株主要分布于分支Ⅰ,而血清1,2,7型主要分布于分支Ⅱ。因此,基于comC的遗传进化分析和基于全基因组的进化分析都对血清型具有较好的区分度,且区分结果有一定的相似性。

OLVERA 等[3]对103个副猪嗜血杆菌菌株的hps60基因的测序及遗传进化关系的分析表明,该基因可作为流行病学研究的一个靶基因,基于该基因的序列分析比ERIC-PCR 指纹图谱方法具有更好的区分效果,hsp60进化树分析结果表明其中一个进化分支上的菌株致病力较高。为了进一步验证comC基因的进化树对副猪嗜血杆菌菌株的区分效果,对已报道的4个潜在毒力基因在3个分支中的分布做了调查。结果表明,fhu A、hsd S、hsd R这3个毒力基因在3个分支中的分布差别较大,而同一分支内的菌株所含毒力因子种类相似。这一方面说明副猪嗜血杆菌不同分离株之间的基因异质性较强,另一方面也说明基于comC基因的进化树分析能够对该菌进行有效的区分。但本研究的3个分支中系统分离株的分布相对均匀,并未发现系统感染分离株含量较为集中的分支。

MORENO 等[13]通过MALDI-TOF 质谱方法对98个临床分离株的蛋白表达谱进行了分析,根据蛋白质表达谱可以将该菌分为2个进化分支A、B,其中A 分支可进一步被分为A1、A2,但研究结果显示基于蛋白表达谱的菌株分类与菌株的感染部位并无关联。为了进一步研究菌株临床致病力与基于comC的菌株分类之间的关系,本研究分析了主要分离部位的菌株在3个进化树分支中的分布,心包积液分离株在3个分支中的分布差别较大,在分支Ⅰ中的比例较高且主要分布在Ⅰ-A 亚群中,在分支Ⅱ中的含量很低,这提示分支Ⅰ-A 和Ⅱ中的菌株对心包的侵入能力可能存在差异。YU 等[11]研究显示心包液和心血分离株都是高毒力菌株,而鼻腔和关节分离株都是中等或低毒力菌株。因此,分支Ⅰ-A和Ⅱ中的菌株是否存在对心包侵入能力的差异值得进一步研究。

本研究以comC基因的遗传进化分析为基础,从血清型、潜在毒力基因和系统感染株的分布等方面进行了探索。结果表明,血清型和潜在毒力基因在各分支中的分布存在明显差异,基于comC的遗传进化分析可以对临床分离株进行有效的区分,但基于comC基因的副猪嗜血杆菌分类方法与致病力的关系尚需进一步研究。本研究为阐明副猪嗜血杆菌菌株分类及其与致病力的关系提供了新的信息。