茶多酚和茶黄素对致龋菌生长作用的研究

崔 霞，李秋艳，李茹芳，蓝 海

0 引 言

龋病是人类最常见的口腔疾病。由于饮食结构的改变，精制碳水化合物食用量增加，口腔保健知识薄弱，龋病发病率呈上升趋势。世界卫生组织(WHO)已将龋齿列为人类重点防治的疾病之一[1]。

茶叶是近年来研究较多的天然防龋物质,主要活性成分茶多酚具有抗菌、抗氧化、抑酶、结合蛋白等生物学作用。已有许多研究证实,茶多酚能抑制致龋菌的生长、产酸及其在牙面的黏附和聚集,同时增强牙体硬组织的抗酸能力[2],从而减少龋病的发生。研究显示, 茶多酚经氧化聚合反应形成的茶色素可能具有比茶多酚更强的医药保健功能[3]，茶黄素 (theaflavins, TFs) 作为茶色素的主要成分，是一种具有抗氧化、抑菌、抗炎作用的黄酮类化合物。金恩惠等[4]发现茶黄素能明显抑制口腔中主要致龋菌生长及产酸，相关机制分析显示, TFs对变异链球菌的葡糖基转移酶 (GTF) 有很强的抑制作用, 且TFs与α唾液淀粉酶的亲和力较强, 在0.6～1.7μmol/L的低浓度下即可抑制50%的α-淀粉酶活性, 从而干扰细菌将蔗糖和淀粉分解为葡萄糖、麦芽糖等的能力, 抑制细菌产酸[5-6]。

变形链球菌、远缘链球菌和粘性放线菌是口腔主要的致龋菌。它们能发酵多种碳水化合物产酸，使菌斑pH降到5以下，还能以蔗糖为底物合成细胞内、外多糖，对牙面获得性膜也有很高的亲和力，这些特点决定了它们在龋病发生中的重要作用[7]。为此本文研究茶多酚和茶黄素抑制口腔致龋菌的生长情况，以探讨茶多酚和茶黄素是否能有效调节口腔生态平衡。

2 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 细菌和培养基供试菌种：变形链球菌(Streptococcus mutans ATCC 25175)、远缘链球菌(Streptococcus sobrinus ATCC 33478)、粘性放线菌(Actinomyces viscosus ATCC 27044)均购于广东省微生物菌种保藏中心。脑心浸液培养基(Brain heart inflision,BHI)：广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2样品茶黄素样品：橙黄色固体粉末，总茶黄素(包括4种茶黄素：TF1、TF2A、TF2B、TF3)含量分别为20%(生产批号：TF20-19092401H)、40%(生产批号：TF40-19092401H)、60%(生产批号：TF60-19092401H)、80%(生产批号：TF80-19092401H)，购于江苏德和生物科技有限公司(茶叶采摘自江西婺源)。

茶多酚样品(生产批号：TP95-19092401H)：淡黄色固体粉末，儿茶素含量为95%。有研究证明儿茶素含量为95%的茶多酚对变形链球菌、远缘链球菌、粘性放线菌有较好的抑制作用[8-9]，购于江苏德和生物科技有限公司(茶叶采摘自江西婺源)。以下简称纯度为20%、40%、60%、80%的茶黄素和纯度为95%的茶多酚。

1.1.3试剂麦氏比浊管：北京索莱宝科技有限公司；洗必泰：上海麦克林生化科技有限公司，分析纯。

1.1.4主要仪器立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，精密电子分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，型号：FA2104)，酶标仪(美国佰腾 型号：BIO-Tek Synergy HT)，隔水式恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，超净台(苏州市金净净化设备科技有限公司)，2.5 L 圆底立式厌氧培养袋(青岛海博生物技术有限公司)，厌氧产气袋(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)。

1.2方法

1.2.1 菌液的制备在37 °C、80% N2、20% CO2厌氧条件下用 BHI 固体培养基培养复苏48 h 后的菌种培养18 h。通过生化鉴定及涂片检查为纯培养后，分别挑取单个菌落于 BHI液体培养基在相同条件下培养18 h，使用麦氏比浊管调整菌悬液浓度至 1×108cfu/mL备用[10]。

1.2.2茶多酚和茶黄素对致龋菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)测定取2 mL 2.3中制备的含药培养液于试管中，加入2.1预备好的菌液20 μL后，置 37 ℃、80% N2，20% CO2、厌氧条件静置培养24 h，以肉眼观察无细菌生长的MIC值。选择大于MIC浓度的各管，分别取20 μL涂布于BHI 固体培养基上，37 ℃、80% N2，20% CO2、厌氧条件静置培养48 h，观察菌落数少于5～6个的MBC，实验重复3次[11]。根据测得MIC值筛选出抑菌效果最佳的纯度为40%的茶黄素、纯度为95%的茶多酚一起进行下一步的实验。其MIC、MBC测定结果见表1。

表1 茶多酚和茶黄素对致龋菌MIC、MBC的测定Table 1 Determination of MIC and MBC of cariogenic bacteria by tea polyphenols and theaflavins

1.2.3茶多酚和茶黄素对致龋菌生长曲线的测定根据茶黄素和茶多酚对实验菌株的 MIC测定结果，选取MIC值以下4个浓度梯度配制BHI液体培养基，按菌悬液与BHI含药液体培养基比例为1∶10(v/v)比例接种此菌后，置37 °C、80% N2，20% CO2、厌氧条件下摇动培养。在0～48 h 内，每隔4小时取样1次，用酶标仪在630 nm处测定其A值，并计算其细菌数，绘制生长曲线。实验设阴性对照和阳性对照。阴性对照为不含药物的培养基中的细菌数，阳性对照组为含0.05% 洗必泰的培养基中的细菌数。各有 3 个平行管，实验重复3次[12]。精确称量洗必泰，制备成浓度为0.05%的溶液，并置于4 ℃冰箱中备用。将茶多酚和茶黄素分别按2倍稀释法溶于BHI 液体培养基中，使药物浓度分别为 0.25、 0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 mg/mL，4 ℃冰箱放置备用。

2 结 果

与空白对照相比较，药物处理后细菌生长对数期的A值差异有统计学意义(P<0.05)。从图中可以看出，茶多酚和茶黄素对变形链球菌、远缘链球菌和粘性放线菌均有抑制作用，且在细菌的生长对数期的抑制作用最为明显，抑制作用随浓度的增加而增大，而且药物作用细菌后使细菌进入衰亡期的时间明显提前，衰亡速度明显加快。茶多酚和茶黄素对变形链球菌和粘性放线菌的抑制作用主要发生在细菌生长前24 h，对远缘链球菌的抑制作用主要发生在细菌生长前16 h，均在细菌对数生长时期。见图1、图2、图3。

图1 茶多酚和茶黄素对变形链球菌生长的影响Figure 1 The effect of tea polyphenols and theaflavins on the growth of Streptococcusmutans

图2 茶多酚和茶黄素对于远缘链球菌生长的影响Figure 2 The effect of tea polyphenols and theaflavins on the growth of Streptococcussobrinus

图3 茶多酚和茶黄素对于粘性放线菌生长的影响Figure 3 The effect of tea polyphenols and theaflavins on the growth of viscous actinomycetes

3 讨 论

茶多酚为茶叶的主要成份，约占茶干重的25%，主要构成为儿茶素、表儿茶素、没食子酰表儿茶素、没食子酰表没食子儿茶素等[13]。主要药效表现在降血酯、降血糖、防治高血压和抗动脉粥样硬化，抗肿瘤、抗突变、防止癌症，抗菌消炎，抗衰老、抗过敏等作用。茶黄素是以儿茶素为主的多元酚类物质氧化形成的水溶性天然色素，研究结果表明茶黄素能明显提高血清超氧化物歧化酶活力，清除氧自由基，降低血清脂质过氧化物含量，降低血胆固醇、三酰甘油，并具抗凝和促纤溶等多种生物功效[4]。从药理药效作用方面，两者有很多相似点。

本实验采用茶多酚和茶黄素对3种致龋菌的抑菌活性进行了研究，结果显示茶多酚和茶黄素对3种致龋菌均有抑制作用。不同纯度茶黄素中，纯度40%的茶黄素抑菌效果最好，与纯度95%的茶多酚效果相当，而纯度20%、60%和80%的茶黄素抑菌效果相对较差，这是由于茶黄素是一种混合物，其中包括茶黄素、茶黄素单没食子酸酯、茶黄素双没食子酸酯、表茶黄酸等活性物质，因此在抑制致龋菌的过程中各个组分存在着协同作用，当各组分比例适当时，其抑菌效果达到最佳。随着对茶黄素各组分分离纯化技术的提高，对于此协同作用的研究会有进一步结果。

通过对致龋菌生长曲线的测定, 发现茶多酚和茶黄素对变形链球菌、远缘链球菌和粘性放线菌的生长均有抑制作用，并导致生长曲线发生显著变化，不同浓度的茶多酚和茶黄素产生不同程度的抑制作用，且在细菌的生长对数期的抑制作用最为明显，抑制作用随浓度的增加而增大。推测可能原因是茶多酚和茶黄素增加了细菌细胞膜通透性, 使细菌细胞内核苷酸和其他重要物质 (如Ca+) 泄漏, 从而抑制细菌DNA的复制, 导致细菌生长缓慢或死亡[14-15]。但随时间延长, 茶多酚和茶黄素抑制作用逐渐减弱, 分析可能原因是MIC值以下的茶多酚和茶黄素能减少致龋菌生长，但没有完全抑制其生长，所以在细菌对数生长期过后，细菌依然能平稳生长[16]。