艾塞那肽4对严重烫伤大鼠胰岛Wnt/β-catenin信号通路的调控机制

孙鹏超，张博涵，申传安，李大伟，钮跃增

0 引 言

严重烧伤后机体会出现以高糖血症为主要症状的糖代谢障碍，进而导致感染易感性增加、创面愈合延迟[1]。胰岛素通过调节葡萄糖在机体内的摄取和利用，在糖代谢中起着关键作用。胰腺作为胰岛素唯一的分泌器官，其结构与功能直接影响着糖代谢稳态的维持[1-2]。胰高血糖素样肽1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一种肠促胰岛素分泌激素，具有改善胰岛β细胞功能并抑制其凋亡的作用[3]。前期研究表明，严重烫伤后大鼠胰腺结构紊乱、胰岛素合成及分泌功能降低，提示烧伤后出现的胰岛素分泌相对不足是烧伤后高糖血症的原因之一，而当给予GLP-1类似物艾塞那肽4后，胰岛素分泌增多，空腹血糖降低，显示出GLP-1类似物可以显著提高烧伤后大鼠胰岛β细胞的胰岛素分泌功能，进而改善糖代谢紊乱[4]。

有研究表明，Wnt/β-catenin信号通路与胰腺的发育以及胰岛素的分泌密切相关，GLP-1及其类似物可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路，增加TCF7L2蛋白的表达从而增强胰岛素分泌功能，改善糖尿病中的糖代谢稳态[5]。基于此，本实验拟给予烫伤大鼠艾塞那肽4探讨其对严重烫伤大鼠胰岛Wnt/β-catenin信号通路的影响及机制。

2 材料与方法

1.1 动物及主要材料48只7周龄SPF级健康雄性Wistar大鼠，体重约(220±20)g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。所有大鼠饲养于20～25 ℃、(50±5)%相对湿度，12 h昼夜循环光照环境中，给予标准食水喂养。大鼠胰岛素Elisa试剂盒购自上海依科赛生物制品有限公司，兔来源non-phospho(active)β-catenin一抗购自美国CST公司，兔来源TCF7L2一抗购自美国Abcam公司，兔来源GAPDH单克隆一抗购自美国Proteintech公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自中国华兴博创基因技术有限公司，TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Removal) 反转录试剂盒、qPCR TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒购自中国全式金生物技术有限公司，DNA引物由上海生工生物工程有限公司制作，Hank′s液购自北京中科迈晨科技有限公司，艾塞那肽4、Ficoll 400及胶原酶V购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2动物分组及模型制备将48只大鼠按照随机数表法分为4组，假烫组、烫伤组、假烫+艾塞那肽4组以及烫伤+艾塞那肽4组，每组12只。在制备大鼠的严重烫伤模型前12 h，对大鼠禁食，自由饮水。大鼠腹腔注射20 mg/mL三溴乙醇工作液(300 mg/kg)麻醉后，腹部背部备皮。烫伤组及烫伤+艾塞那肽4组背部浸入94 ℃热水12 s，腹部浸入94 ℃热水6 s致50% TBSA Ⅲ度烫伤(经病理切片证实)，假烫组及假烫+艾塞那肽4组背部浸入37 ℃热水12 s，腹部浸入37 ℃热水6 s模拟致伤。伤后即刻所有大鼠按照Parkland公式腹腔注射乳酸林格氏液复苏，碘伏棉球消毒致伤部位，并将大鼠置于28 ℃保温架下复温。假烫+艾塞那肽4组及烫伤+艾塞那肽4组腹腔注射艾塞那肽4(4 μg/kg，2 次/d)。假烫组及烫伤组腹腔注射等量灭菌注射用水(2 次/d)。所有大鼠在伤后60 h禁食，伤后72 h进行相关实验。本实验遵循解放军总医院和国家有关实验动物管理和使用的相关规定。

1.3检测大鼠空腹血糖与腹腔糖耐量试验(IPGTT)按照随机数表法随机选取6只大鼠进行编号，大鼠尾端1 mm处剪尾，将流出血液滴于血糖仪试纸上，利用Performa型血糖仪进行检测(瑞士Accu-Chek公司)，记录各组大鼠伤前及伤后72 h的空腹血糖。腹腔注射100 g/L的葡萄糖溶液(2 g/kg)后检测并记录注射葡萄糖后5、15、30、60、90、120 min血糖值。绘制血糖浓度-时间曲线，计算血糖-时间曲线下面积(AUC)。

1.4Elisa检测大鼠血清胰岛素按照随机数表法随机选取6只大鼠麻醉，腹主动脉采血， 以离心半径12 cm，3000 r/min离心，收集血清。在孔板中分别加入相应的标准品和样品；加入生物素化抗体工作液，用封板胶纸封住反应孔。室温下震荡孵育，洗板；加入酶结合物工作液，用封板胶纸封住反应孔；室温下再次震荡孵育，洗板5次；加入显色底物室温下避光孵育；加入终止液，混匀后即刻在Synergy 2多功能酶标仪(美国BioTek公司)测量A450值。绘制标准曲线，计算各样品胰岛素浓度。

1.5提取大鼠胰岛各组大鼠由腹主动脉采血后，钝性分离胆总管远端并用5 mL针头将其扎破，经破口处插入PE导管并用1-0丝线固定，破心处死，待胰腺转为苍白后，1-0丝线固定胆总管近心端，经导管缓慢逆行注射预冷的胶原酶V，待胰腺腺叶完全膨胀后，拔出导管，迅速钝性分离、摘取胰腺置于离心管中，37 ℃水浴锅中消化10 min后，加入4 ℃预冷的FBS终止消化，过滤，弃去消化残渣，滤液4 ℃以离心半径8 cm、1000 r/min离心3，弃去上清液，沉淀物中加入4 ℃ 预冷的Hank′s液4 ℃1000 r/min离心2 min洗涤，弃上清液。沉淀物加入25% Ficoll 400 4 mL，混匀后依次缓慢加入23%、20%、11% Ficoll 400、Hank′s液各2 mL，以离心半径8 cm、3000 r/min 4 ℃离心20 min，吸出23%～20%及20%～11%界面的胰岛，用Hank′s液4 ℃下洗涤备用。

1.6免疫印迹法检测提取各组胰岛组织总蛋白并测量蛋白浓度，电泳分离蛋白样品，湿法转移至聚偏氟乙烯膜，50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h，加入兔来源Non-phospho β-catenin一抗(稀释比为1∶1000)、兔来源TCF7L2一抗(稀释比为1∶1000)以及兔来源GAPDH单克隆一抗(稀释比为1∶1000)4℃过夜，洗去一抗加山羊抗兔IgG二抗(稀释比为1∶10 000)。化学发光、显影后用Gel Doc XR+型凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)曝光获取图像并利用配套软件自动计算蛋白灰度值。蛋白表达水平以目的蛋白灰度值与内参照GAPDH灰度值比值表示。

1.7实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)进行RNA提取，Primer Premier设计或文献查找引物，将 RNA 反转录成 cDNA，反转录条件如下：50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s；然后，在CFX Connect Real-Time System中进行聚合酶链式反应，反应条件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s ，72 ℃ 10 s，循环45次。引物信息如下：GAPDH：5′-TTCCTACCCCCAATGTATCCG-3′ and 5′-CATGAGGTCCACCACCCTGTT-3′; Preproinsulin: 5′-TGGAGGCTCTGTACCTGGTGTG-3′ and 5′-TCCACAATGCCACGCTTCTGC-3′；TCF7L2：5′- CACACCGACAGTCAAGCAGGAG -3′ and 5′- GCCACCACCTTCGCTCTCATC -3′。

2 结 果

2.1 大鼠空腹血糖浓度烫伤后，与假烫组相比，烫伤组及烫伤+艾塞那肽4组空腹血糖明显升高(P<0.01)；与烫伤组相比，烫伤+艾塞那肽4组空腹血糖浓度明显降低(P<0.01)。见表1。

表1 大鼠烫伤前后血糖水平Table 1 Blood glucose levels before and after injury

2.2大鼠糖耐量水平及血清胰岛素浓度与假烫组相比，烫伤组及烫伤+艾塞那肽4组血清胰岛素浓度明显升高(P<0.01), AUC值亦明显升高(P<0.01)； 与烫伤组相比，烫伤+艾塞那肽4组血清胰岛素浓度明显升高(P<0.01), AUC值下降(P<0.01)。提示烫伤导致大鼠糖耐量水平下降，给予艾塞那肽4治疗后可以明显改善大鼠糖耐量水平。见图1， 表2。

图1 大鼠IPGTT血糖-时间变化曲线Figure 1 IPGTT glucose-time curve

表2 大鼠IPGTT AUC及血清胰岛素结果Table 2 Area under curves of IPGTT and Serum insulin levels

2.3大鼠胰岛中β-Catenin及TCF7L2蛋白表达水平与假烫组相比，烫伤组、烫伤+艾塞那肽4组 β-Catenin及TCF7L2蛋白表达水平明显降低(P<0.01)；与烫伤组相比，烫伤+艾塞那肽4组β-Catenin及TCF7L2蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。见图2。

1:假烫组;2:假烫+艾塞那肽4组;3:烫伤+艾塞那肽4组;4:烫伤组a:Western blot检测； b:β-catenin; c:TCF7L2*P<0.01图2 大鼠胰岛Non-phospho β-Catenin和TCF7L2蛋白表达水平Figure 2 Expression of Non-phospho β-catenin and TCF7L2

2.4大鼠胰岛中Preproinsulin及TCF7L2 mRNA转录情况与假烫组相比，烫伤组及烫伤+艾塞那肽4组Preproinsulin及TCF7L2 mRNA转录明显降低(P<0.01)；与烫伤组相比，烫伤+艾塞那肽4组Preproinsulin及TCF7L2 mRNA转录明显升高(P<0.01)。见图3。

a:TCF7L2； b:Preproinsulin>*P<0.01>图3 大鼠胰岛Preproinsulin mRNA转录情况Figure 3 Transcription of preproinsulin mRNA

3 讨 论

本研究中，大鼠空腹血糖及IPGTT结果表明，严重烫伤大鼠与正常大鼠相比，空腹血糖明显升高，同时糖耐量水平明显降低。胰岛素在糖代谢的稳态调节中起着重要的作用，既往研究表明严重烫伤导致的明显肝损伤以及胰岛素抵抗，会进一步引起循环胰岛素的清除以及利用减少，继而出现血清胰岛素升高的现象[6-7]，本实验中烫伤组大鼠血清胰岛素含量明显高于假烫组大鼠。烫伤后72 h属于烧伤休克期，李大伟等[8]研究表明，严重烫伤后大鼠胰岛细胞功能因为缺血缺氧、炎性因子、长期高血糖等因素产生严重的损伤;严重烧伤引起的氧化应激以及炎性因子的大量释放会导致血运丰富的胰腺组织受到较大损伤，同时胰岛凋亡数量增加并伴有胰岛素合成及分泌功能的明显降低，继而导致的胰岛素分泌相对不足可能是引起烧伤后糖代谢紊乱的重要原因。

Wnt蛋白作为一种富含半胱氨酸的分泌蛋白具有疏水性，是一种由原癌基因Wnt编码，包含350～400个氨基酸残基(相对分子质量约40 000)的信号转导途径配体蛋白[9-11]。Wnt蛋白在基质细胞中受到通路调节因子的作用后具有了活性可以与Wnt受体结合。细胞中产生的Wnt蛋白经过内质网加工，在Wntless膜蛋白和Evi/Sprinter跨膜蛋白的帮助下转运[12]。Wnt/β-catenin信号通路广泛参与胰腺的生长、分化以及胰岛素分泌等生理活动中，具有重要作用[12-14]。目前认为，当Wnt/β-catenin信号通路Fzd受体与Wnt配体结合使通路激活时，由Axin/GSK3β/APC组成的多蛋白降解复合体受到抑制，从而使细胞质内β-catenin磷酸化减少，游离的β-catenin增多并进入细胞核中与TCF/LEF结合，启动包括TCF7L2以及特异性周期蛋白D1等在内的众多下游靶基因转录[15-16]。多项研究表明Wnt/β-catenin信号通路与糖尿病及胰腺癌等胰腺疾病的发生具有密切联系[17-18]。不同的Wnt蛋白刺激打开的Wnt通路会有所差别，同时不同的Wnt蛋白会激发不同的靶基因的表达。Dijksterhuis等[19]学者研究表明：FZD受体与Wnt配体蛋白的结合具有特异性，不同的Wnt-FZD结合对下游蛋白的磷酸化有不同的影响，这也就意味着，不同的Wnt配体蛋白与相应的FZD受体结合后，开启特定的Wnt信号通路。在正常的胰岛细胞中Wnt/β-catenin信号通路也存在开启状态，维持机体血糖平衡及胰腺功能的正常运行；在严重烫伤大鼠由于胰腺受损Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin及TCF7L2相对表达量下降，推测Wnt/β-catenin信号通路活性可能降低，胰岛素分泌量降低不能满足机体需要。

GLP-1是一种从肠道分离出的肠促胰岛素，具有促进胰岛β细胞胰岛素合成及分泌的作用，在糖尿病治疗领域研究广泛[4]。其中，艾塞那肽4与GLP-1具有相同的生物学活性和药理作用，同时体内半衰期长，因此被作为GLP-1的类似物广泛用于各项研究之中[20]。本研究结果显示，经过艾塞那肽4治疗的烫伤大鼠，空腹血糖显著降低，且血清胰岛素浓度显著升高，其葡萄糖耐量也回复正常水平。

TCF7L2基因位于人类10号染色体长臂25区，其翻译产物是Wnt/β-catenin信号通路的关键转录效应因子，TCF7L2基因的多态性与糖尿病患病风险相关[15-16,21]。研究表明，小鼠敲除TCF7L2基因可以导致小鼠糖耐量受损，同时，2型糖尿病患者胰岛中TCF7L2蛋白水平也显著降低[22-23]。本研究结果显示，严重烫伤可以导致胰岛Wnt/β-catenin信号通路活性降低，TCF7L2蛋白表达减少，提示Wnt/β-catenin信号通路及TCF7L2蛋白可能参与了伤后胰岛素分泌减少的调控。而使用艾塞那肽4对严重烫伤大鼠进行治疗，可以提高大鼠胰岛Wnt/β-catenin信号通路活性，增强TCF7L2的转录与表达，并促进胰岛素转录，帮助维持伤后大鼠正常的糖代谢水平。

综上所述，严重烫伤后大鼠胰岛素分泌功能下降与胰岛Wnt/β-catenin信号通路活性降低可能有一定的相关性，而当给予艾塞那肽4以后，胰岛Wnt/β-catenin信号通路活性增加，TCF7L2表达上调，胰岛素转录及分泌增加，使严重烫伤后大鼠糖代谢紊乱得到改善。本研究为严重烧伤后糖代谢障碍的发生及治疗提供了新的理论支持。因此，可尝试应用GLP-1及其类似物或是其他Wnt/β-catenin信号通路增强剂，预防和改善严重烧伤后出现的顽固性高血糖及糖代谢紊乱。