荧光定量PCR基因检测对G6PD缺乏症的诊断价值探讨

王亨莉，钟志娟 (中山大学附属第五医院，广东 珠海 519001)

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏症是世界上最常见的红细胞酶病。目前统计，约有4亿人口存在G6PD缺陷。本病常见于疟疾高发区、地中海贫血和异常血蛋白病等流行地区出现，地中海沿岸、东南亚、印度、非洲和美洲黑人的发病率较高[1]。我国分布规律呈“南高北低”的态势，长江流域以南，尤以广东、海南、广西、云南、贵州、四川等地为高发区，发生率为4%～15%，个别地区高达40%[2]。该病是由于调控G6PD的基因突变所导致的，是X连锁不完全显性遗传，G6PD是红细胞糖代谢戊糖磷酸途径(包括GSH代谢途径)中的一种重要酶类，其主要功能是生成潜在抗氧化剂红细胞还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，后者为维持谷胱甘肽还原状态所必需[3]。G6PD基因异常表达会导致红细胞糖代谢戊糖磷酸途径代谢异常，NADP不能转变成NADPH，后者不足则使体内的两个重要抗氧化损伤的物质GSH及过氧化氢酶(CAT)不足，从而血红蛋白和红细胞膜均易于发生氧化性损伤[4]。临床表现为溶血性贫血或蚕豆病。因此，寻求更方便、快捷的诊断方法有利于临床上及时治疗G6PD缺乏症的患者。目前，临床上常见的诊断手段有高铁血红蛋白还原法、荧光斑点试验、硝基四氮唑蓝纸片法[5]。高铁血红蛋白还原法简便快捷，但特异性较差，荧光斑点试验敏感性和特异性较高，但不够快捷，硝基四氮唑蓝纸片法特异性较差[6-9]。因此，寻找一种简便快捷、特异性高、灵敏度好的检测方法有重要意义。本研究旨在探究荧光定量PCR对于G6PD缺乏症患者的诊断价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取本科室自2018年1月～2018年10月接收的100份血样(阴性标本和阳性标本各50份)，入选本研究的血样均应符合以下的纳入排除标准：纳入标准：①阳性血样提供者经诊断是G6PD缺乏症患者；②阴性血样提供者为健康正常人，无任何血液系统疾病；③血样提供者BMI值在18.4～28.6 kg/m2范围内。排除标准：①有先天性心脏病或其他血管疾病；②患有恶性肿瘤的患者；③有肝肾疾病的患者；④有其他血液系统性疾病的患者。其中，阳性标本提供者(n=50)男28名，女22名，年龄6～42岁，平均为(28.9±3.2)岁；阴性标本提供者(n=50)男25名，女26名，年龄8～38岁，平均为(28.1±3.5)岁。阴性标本和阳性标本提供者的一般资料包括性别、年龄、BMI等比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2仪器及试剂：赛默飞ABI荧光PCR仪；AU5800系列全自动生化分析仪；高铁血红蛋白还原实验MHBR试剂(0.0004M美兰和2.5%NaNO等比例混合)；测定G6PD改良版试剂盒；TaqMan探针(美国Nova公司)；Taq酶(美国APE BIO公司)；引物(上海芯超生物科技有限公司)；QIA amp DNA Blood Mini Kit(上海芯超生物科技有限公司)。

1.3高铁血红蛋白还原法： 取新鲜的静脉血0.9 ml，加入肝素抗凝剂0.1 ml,充分混匀，低速离心10 min，取出后调整血细胞和血浆的比例为1∶1后再次混匀，得到抗凝血。用移液枪移取上述抗凝血50 μl，并加入高铁血红蛋白还原实验MHBR试剂50 μl，充分混匀，在恒定温度37 ℃条件下放置3 h，后取出加入4.9 ml蒸馏水，混合均匀，2 min后，即会显色。若颜色为呈鲜红色者，则是正常情况；若颜色呈棕色、紫色或者棕红色则是缺乏G6PD。颜色与血红蛋白的还原率有关，正常人还原率≥75%，对于G6PD缺陷症患者来说，高铁血红蛋白还原率降低，所呈现的颜色便不同[10-12]。

1.4荧光定量PCR：首先用QIA amp DNA Blood Mini Kit来提取得到DNA，若不能及时进行PCR，则应先储存在-20 ℃冰箱中。之后应根据文献查阅的该DNA可能存在的5个突变位点设计引物(由上海芯超生物科技有限公司合成)。然后混合的以下PCR反应体系：2 μl DNA；1 μl引物；2 μl Taq酶;1 μl TaqMan探针；4 μl 5X Prime script Buffer 2。设定PCR程序是85 ℃预变性 515 min；85 ℃ 20 s，4 ℃ 10 μ，共30个循环；65 ℃ 30 s采集荧光信号。在赛默飞ABI荧光PCR仪分析数据[13-14]。

1.5统计学分析：本研究所得所有数据及资料均使用SPASS 19.0软件进行统计学分析，对数据及资料进行t检验，主要是得到数据的置信区间及数据是否有统计学差异。导入数据样本，执行“分析-比较均值-单样本t检验”，一般设定置信区间为95%，确定之后分析得结果，观察P值，P>0.05时，差异无统计学意义：当P<0.05时，数据间存在的差异才有统计学意义。

2 结果

观察组的特异性、灵敏度、阴性预测值、阳性预测值、诊断符合率均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 观察组与对照组结果比较

3 讨论

G6PD缺乏症是一种遗传病，发病率高，寻找有效快速方便的检测手段对于临床治疗至关重要。本研究表明，荧光定量PCR是一种很好的检测手段，比临床传统的高铁血红蛋白还原法有高特异性、高灵敏度、高阴性预测值、高阳性预测值和高的诊断符合率。因此，荧光定量PCR可作为诊断 G6PD缺乏症的新型技术手段在临床上推广[15]。但目前该技术尚存在局限性，如基因突变位点需要进行筛查并合成相关引物，前期工作重大，但笔者认为，随着医学技术的不断发展，该技术所需的基因突变位点和相关引物会不断完善。