多发性骨髓瘤骨髓组织中磷脂酰肌醇-3激酶表达及其临床意义

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）为骨髓浆细胞恶性疾病，约占整个血液系统恶性肿瘤的10%以上，多见于老年人，现阶段随着人口老龄化进程的加快，我国MM的发病率逐年升高[1]。目前MM的治疗主要通过联合化疗及自体干细胞移植，然而治疗过程中仅有一小部分患者受益，绝大多数患者的生存和预后并未得到改善，因此寻找更有效的治疗方案与手段对改善MM患者的预后具有重要意义[2，3]。磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）由蛋白质合成，在转录与翻译过程中调节靶基因的表达，与肿瘤的发生及发展密切相关，参与细胞周期调节，促进肿瘤细胞的增殖[4，5]。本研究通过检测MM患者骨髓血浆PI3K水平，判断其在不同分期患者中的差异，阐述其与患者预后的关系，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选择2013年1月～2015年5月我院住院MM患者40例，其中男19例，女21例；年龄40～75岁，平均（56.33±3.59）岁；依照DS分期标准包括Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期18例。另选取同期于我院门诊就诊者，通过临床和骨髓穿刺排除血液疾病，其中男20例，女20例；年龄41～77岁，平均（56.18±3.66）岁。纳入标准：①所有患者均签订骨髓穿刺同意书，通过临床和骨髓穿刺、免疫固定电泳等检查确诊；②经医院伦理委员会批准，患者及家属知情同意。排除标准：①肝实质病变或有机磷中毒者；②原发性浆细胞白血病或反应性浆细胞增多症者；③合并慢性呼吸道疾病；④合并其他恶性肿瘤、创伤或感染者；⑤合并其他全身性疾病者。

1.2 免疫组织化学法 所有非肿瘤骨髓组织标本通过10%的中性福尔马林进行固定，通过石蜡包埋后制片，通过免疫组织化学SP三步法进行检测，试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，修复抗原，在室温条件下以3%的H2O2孵育20min，灭活过氧化物酶活性，PBS液冲洗，滴加正常山羊血清工作液，于室温条件下孵育20min，加入一抗，4℃条件下放置12h，再次以PBS液冲洗，滴加二抗，孵育25min，再以PBS液冲洗，加入辣根酶标记链酶卵白素工作液，孵育25min，PBS液冲洗，以DAB显色液显色，最后采用蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。

1.3 染色结果判断 由2名病理科医师采用双盲法评估。在高倍镜下随机选取5个以上的不同高倍镜视野，同时需保证每一个视野能够观察到的细胞数在200个以上，阳性细胞表达为细胞质呈现淡黄色或棕黄色，依照阳性细胞所占的百分比进行评分[6]：阳性细胞≤5%计0分，阳性细胞为5%～10%计1分，11%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分，0分为无表达（-），1分为低表达（+），2分为中度表达（++），3分为高表达（+++），4分为极高表达（++++）。

1.4 化疗方案 采用VAD+MelP（VCR 0.5mg d1～d4，THP 10mg d1～d4，DEX 20mg d1～d4，MelP 6mg Bid d1～d4），合并肾功能不全者，可依据肌酐清除率水平调整MelP用量；合并尿毒症患者，不使用MelP；合并骨骼病变患者，化疗前使用两次2、3代骨磷酸盐，骨骼症状明显或孤立病灶加用局部治疗。

1.5 临床病理特征

1.5.1 DS临床分期标准 Ⅰ期：血钙正常，血红蛋白≥100g/L，X线显示骨髓表现正常或仅存在少量孤立性浆细胞，IgA＜30g/L，IgG＜50g/L，尿本周蛋白＜4g/24h；Ⅱ期：介于Ⅰ期和Ⅲ期之间；Ⅲ期：符合以下一项或多项：血红蛋白＜85g/L，血钙水平＞2.98mmol/L，多处发生溶骨性病变，IgA＞50g/L，IgG＞70g/L，尿本周蛋白＞12g/24h[7]。

1.5.2 ISS分级标准 1级：血清β2微球蛋白含量＜3.5mg/L，血清白蛋白含量＞35g/L；2级：介于1级和3级之间；3级：血清β2微球蛋白含量＞5.5mg/L[8]。

1.5.3 骨病分级 0级：未出现骨质破坏；1级：普通骨质疏松或有1处出现骨质溶骨性破坏；2级：超过1处少于3处出现骨质破坏症状；3级：超过3处出现骨质破坏，或出现病理或压缩性骨折[9]。

1.5.4 生活自理状况 1级：患者存在临床症状，但不影响日常生活；2级：患者日常生活可自理，且每日需卧床休息半天以下；3级：患者日常生活可自理，且每日需卧床休息半天以上；4级：患者卧床不起，生活不能自理[10]。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件，率之间的比较采用卡方检验，生存率分析通过Kaplan-Meier模型，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PI3K在正常及MM骨髓组织中的表达 MM患者骨髓组织中PI3K阳性表达率高于正常骨髓组织，见表1。

表1 PI3K在正常与MM骨髓组织中的表达情况比较

2.2 PI3K表达和临床病理特征之间的关系 骨质破坏≥3分、日常生活自理能力较差患者PI3K阳性率高于其他患者，DS分期Ⅲ期患者PI3K阳性率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，ISS分级3级患者PI3K阳性率高于1～2级患者，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 MM骨髓组织中PI3K表达与临床病理特征的关系[n（%）]

2.3 PI3K阳性与阴性表达MM患者化疗后生存时间 PI3K阴性患者3年无进展生存率为72.73%，高于PI3K阳性组48.28%（P<0.05）；PI3K阴性患者3年总生存率为81.82%，高于PI3K阳性患者62.07%，（P<0.05）。见图1、2。

图1 3年无进展生存率

图2 3年总生存率

3 讨论

MM肿瘤细胞起源于浆细胞，其发病和癌基因的激活与抑癌基因的失活及骨髓微环境的改变、多种细胞因子相互作用等因素有密切关系，患者常伴有多发性溶骨性损害、贫血、高钙血症、肾脏损害，患者由于正常的免疫球蛋白的生成受到抑制，易导致各种细菌性感染的发生[11]。

PI3K由一个催化亚基和一个调节亚基构成，细胞受到生长因子刺激后，PI3K活化[12]。PI3K下游的Akt可与PIP3结合，并经磷脂酰肌醇依赖性激酶1，2使第308位上的苏氨酸及473位上的丝氨酸被激活。活化后的PI3K/Akt通路激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，磷酸化后进一步激活P70S6激酶，使下游核糖体S6激酶活化，促进核糖体蛋白的翻译过程，与此同时哺乳动物雷帕霉素靶蛋白还可将4EBP1磷酸化，使其从elF4E中解离，促进后者对于cyclinD1等周期调节蛋白的翻译过程。PI3K信号通路可调节细胞周期，具有抗凋亡和调节瘤细胞生存的作用，还有利于血管的形成，增强肿瘤的侵袭性，促进肿瘤的转移[13]。

本研究中MM患者骨髓组织PI3K阳性率明显高于正常组织，MM组织中PI3K信号活化，促进瘤细胞增殖与分化过程，反过来又进一步活化更多PI3K信号，使得PI3K浓度进一步升高。本研究对比各种免疫类型骨髓血浆PI3K阳性率差异，其中IgE和IgD类型本研究未纳入有效病例，对比其他几种免疫类型和PI3K阳性率的关系，IgG型、IgA型、轻链型PI3K阳性率均未有明显差异，提示PI3K表达增高可能是各种类型MM患者表现出的一种共同信号，也有可能与本研究所纳入的样本数量过少有关。DS临床分期侧重评估患者总体瘤负荷，涉及多种参数[14]。本研究中Ⅲ期患者PI3K阳性率高于Ⅰ、Ⅱ期患者，表明患者体内PI3K水平和瘤负荷相关。ISS临床分期是近年来提出的MM临床分期指标，虽只涉及血清β2微球蛋白和血清白蛋白含量，但血清β2微球蛋白和体内骨髓瘤细胞总数密切相关，血清白蛋白是负性急性期蛋白，与瘤细胞的生活与增殖具有密切关系，因此ISS临床分期在预测MM患者化疗治疗后的生存情况方面具有重要价值，本研究中ISS临床分期和MM患者PI3K阳性率相关，提示瘤负荷状态，对于负荷越高者，其包括自分泌或旁分泌在内激活的PI3K信号的途径则越强，上述研究显示，PI3K阳性表达率越高者，疾病分期更接近于晚期。

林琳等[15]研究表明骨骼破坏为MM患者最常见的临床症状之一，瘤细胞和骨髓基质细胞相互黏附后激活大量破骨细胞激活因子等，导致破骨细胞和成骨细胞动态平衡遭到破坏，造成溶骨性破坏。MM患者瘤负荷越高，骨质破坏越严重。本研究中PI3K水平与骨髓瘤的分级有关，PI3K的阳性表达率随骨质破坏严重程度增高。同时本研究中患者日常生活自理能力与PI3K阳性表达率存在一定的关系，这也从侧面说明了PI3K的阳性表达和骨髓病变的严重程度相关，Piddock 等[16]研究结果支持本结论。对两组患者随访至化疗治疗后3年，PI3K阳性表达患者3年无进展生存率与总生存率均低于PI3K阴性表达患者，阐明了PI3K在预测MM患者预后方面的价值。

综上所述，PI3K在MM骨髓组织中高表达，与患者临床病理特征具有密切关系，可作为判断MM患者预后的标志物之一。