miR-21通过调控IL-6表达水平参与脑卒中复发研究

我国已进入老龄化社会，脑卒中已成为死亡的重要原因之一。其包括缺血性脑卒中及出血性脑卒中，在脑血管疾病中缺血性脑卒中的发病率一直居高不下。迄今为止，脑卒中尚缺乏有效的临床治疗手段。曾患脑卒中的患者，再次发生心脑血管疾病的可能性相比较正常人也普遍偏高，因此治疗脑卒中是一个漫长的过程，患者需要忍受巨大痛苦，同时给社会和家庭带来沉重负担[1，2]。

近年来，关于脑卒中的免疫理论普遍认为脑卒中后T淋巴细胞被过多激活，可以分泌产生大量促炎性细胞因子。炎症因子不仅在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，而且对于内环境稳态的维持也至关重要。并且进一步研究发现，脑卒中患者发病时病情越严重，患者体内微环境的动态平衡越易被打破，免疫调节功能同时被激活，随之引发一系列的连锁反应，最重要的是，炎性相关介质的分泌增多对脑卒中的进展起到重要作用。

对microRNAs（miRNA）的研究非常广泛，在实体肿瘤、血液系统疾病，以及神经损伤修复方面都有着深入的研究，作为一类长度为22nt左右的非编码小RNA，分子量虽然小，结构相对简单，但能够发挥巨大的生物学作用。普遍认为miRNA通过抑制或者激活信号通路中特定的靶基因发挥作用。研究发现，脑卒中患者血清miR-21的表达明显上调，但miR-21参与脑卒中的机制仍需进一步研究。miR-21可通过下调PDCD4的表达来促进细胞增殖[2]。另外，miR-21的过表达可以抑制正常细胞凋亡的信号传导，因此，抑制miR-21可促进细胞凋亡。

脑卒中发病机制复杂，病情变化多样，复发风险较高。血清中的细胞因子和miRNA与脑卒中的发病有着密切联系[3]，可能为判断预后和预测复发提供一定的方向。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取山东省安丘市人民医院神经内科2013年1月1日～2014年12月31日的急性脑梗死患者，年龄30～80岁，符合急性脑梗死的临床诊断标准，首次发病至入院时间在 12h之内，所有患者经过头颅CT或MRI检查证实，此作为脑梗死组（ACI组）。对照组为同时期的正常健康体检者。本研究中采用的所有标本均为临床检查后废弃样本。所有样本以及患者病历经过我院伦理中心审查，符合伦理规范。

1.2 临床神经功能缺损程度评分 依据美国国立卫生研究院脑卒中量表（NIH Stroke Scale，NIHSS）对脑梗死组发病后12h、1d、3d、5d、7d、14d进行评分。为提高评分准确性，操作前进行人员培训，对每位患者进行评分时，均由同一名神经科医师进行，以提高评分准确性。

1.3 ELISA检测血清中IL-6和STAT3的含量 血清IL-6和STAT3的检测采用双抗体夹心抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）法（美国Abcam，ab46042）。ACI组：收集患者发病后12h、1d、3d、5d、7d、14d的静脉血3～5ml，放置于真空促凝管中，在4℃冰箱里静置60min，2 500r/min，离心10min，收集血清，分装2～4管，每管400～500μl，进行标记，放置于-20℃的冰箱中保存。对照组抽取静脉血1次3～5ml，血清收集同ACI组。在酶标仪上450nm处测光密度（OD值），IL-6和STAT3浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线求得IL-6和STAT3的浓度。

1.4 实时定量PCR检测血清中miR-21的含量提取血清miRNA后，采用试剂盒进行miRNA逆转录。miRNA逆转录：实时定量PCR，引物：U6引物，miR-21引物（美国Genecopoeia公司）操作按照Allin-One miRNA实时定量试剂盒（美国Genecopoeia公司）说明书进行，miR-21/U6表示miR-21的相对表达量。以正常体检者的miR-21含量作为对照组，对比分析ACI组血清miR-21的表达情况。

1.5 缺血性脑卒中复发标准 ①原有的神经缺失症状和体征好转或消失后，再出现新的同侧或对侧的神经功能缺损症状；②经头颅CT和（或）MRI检查证实有新发病灶；③排除进展性卒中或病情恶化所致；④排除因颈动脉支架术或血管成形术后并发缺血性卒中患者。

1.6 统计学方法 应用SPSS 22.0统计学软件对所得数据进行处理，其中正态分布的计量资料结果采用均数±标准差（±s）表示。IL-6、miR-21与其它指标的相关性分析采用直线Spearman等级相关分析，取α=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 两组的年龄、性别、饮酒史、高血压及吸烟史未见明显差异（P>0.05）。ACI组的TC、TG、LDL、Cr、AST、ALT平均数值均高于对照组，但无统计学差异（P>0.05）。ACI组的HDL平均数值低于对照组，但无统计学差异（P>0.05）。见表1。

2.2 两组血清miR-21表达水平对比 采用实时定量PCR方法检测对照组和ACI组发病后12h、1d、3d、5d、7d、14d外周血miR-21水平，对照组miR-21相对表达量个体之间存在差异，为1～16，平均为8.1±7.7。miR-21在发病后12h迅速升高，第1天和第3天miR-21表达量继续维持较高水平。第5天开始逐渐下降，与对照组相比，有统计学差异（P<0.05）。第14天时miR-21表达量降至大致正常水平，与对照组相比，无统计学差异（P>0.05），见表2。

表2 两组血清miR-21/U6水平对比

2.3 两组血清IL-6水平对比 ACI组患者血清IL-6水平在发病后第12h开始升高，第1天达到高峰，与对照组相比有统计学差异（P<0.05）。第3天略有下降，第5天下降明显，第7天下降至（126.85±59.63）pg/ml，与对照组相比，有统计学差异（P<0.05）。第14天降至大致正常水平，与对照组相比，无统计学差异（P>0.05）。见表3。

表3 两组血清IL-6水平对比（pg/ml）

2.4 两组血清STAT3与IL-6水平变化趋势对比ACI组血清STAT3水平在发病后第12h开始迅速升高，第1天达到高峰，与正常对照组相比有统计学差异（P<0.05）。第3天开始逐渐下降，第7天和第14天降至大致正常水平。见表4。进一步分析发现，ACI患者血清STAT3和IL-6随时间变化趋势一致。见图1。

2.5 IL-6和miR-21/U6峰值水平与ACI复发的关系当IL-6峰值小于250pg/ml时，ACI患者1年内仅有1例复发。当IL-6峰值水平显著增高时，ACI复发的患者迅速增加，分别为15.8%和40.9%，发现IL-6水平越高，复发率越高。当miR-21/U6峰值小于30时，ACI患者1年内仅有2例复发。当miR-21/U6峰值水平显著增高时，ACI复发的患者迅速增加，分别为55.6%和50.0%，通过对不同的miR-21/U6表达水平分组，发现miR-21/U6水平越高，复发率越高。见表5、6。

表4 两组血清STAT3水平对比（pg/ml）

图1 ACI患者血清STAT3和IL-6水平随时间变化趋势

表5 ACI患者IL-6峰值水平与复发情况对比

表6 ACI患者miR-21/U6峰值水平与复发情况对比

3 讨论

现阶段，人民生活水平提高，高血压、高血脂、糖尿病等基础代谢疾病发病率升高，心脑血管疾病的发病率也呈现逐年上升趋势。对老年人群的脑卒中生理及病理发病机制研究日渐深入。但脑卒中病情复杂多变，预后较差。其不仅发病率高、死亡率高，而且有过脑卒中病史的人群，再次发生心脑血管疾病的可能性较正常人高。脑卒中的治疗已经取得了长足进步，患者预后得到了明显改善。但已经发生过脑卒中的患者，在未来5年内，再次发生脑卒中的几率接近1/5。故对既往脑卒中后患者以及社区高危人群进行定期筛查，做好相应的一级预防至关重要。如果患者不幸罹患了脑卒中，应该在发病后及时进行准确诊断以及有效治疗，这对脑卒中患者的预后至关重要。在治疗过程中，应该对患者病情准确评估，及时、合理、有效地进行溶栓等治疗，能够减轻患者痛苦，提高患者出院后的生活质量。同时对患者存在的高血压、高血糖、高血脂、动脉粥样硬化等不良预后指标进行有效监控，可以明显降低脑卒中发病率、改善脑卒中患者预后[4]。脑卒中的发病过程十分复杂，颅脑生理结构及对应的功能复杂，若脑卒中发病过程中大脑的锥体束受累，会导致机体运动神经元异常。神经细胞不可再生，损伤后难以修复，脑卒中患者发生一系列的神经结构异常后，即使患者经过有效治疗后出院，其神经功能也难以恢复到正常，导致脑卒中患者神经损伤后致残率较高，生活质量差，进而造成沉重的家庭和社会负担。

脑卒中的发生是一个急性过程，但其诱因的积累是一个慢性过程。血管动脉粥样硬化是一种常见的系统性疾病，且越来越年轻化，动脉粥样硬化是影响老年患者心脑血管疾病的常见问题之一。其会导致血管狭窄，甚至血管闭塞，例如，冠状动脉粥样硬化的患者其心绞痛、心肌梗死的发病率远远高于正常人。因此动脉硬化是脑卒中发病率、致残率、致死率高的重要因素之一。随着社会发展，生活水平的提高，人们不良的生活习惯以及生活环境是脑卒中发病率逐年升高的重要原因。脑卒中起病往往比较急骤，常常因为患者家庭距离医院较远，送医不够及时，入院后诊断不明确，治疗不及时等一系列问题，导致预后不良。

通过分析脑卒中的发病人群情况，发现老年人居多，且患者糖尿病、高血压，甚至恶性肿瘤等基础疾病多。本研究发现，ACI组和对照组的年龄、性别、饮酒史、高血压及吸烟史未见明显差异。高血压和吸烟可能与ACI有关，但本研究入组例数较少，暂时无统计学差异。进一步分析，ACI患者的TC、TG、LDL、AST、ALT平均数值均高于正常对照组，HDL平均数值低于对照组，但无统计学差异。ACI患者的HDL平均数值低于正常对照组。本研究进一步证实了ACI患者血脂普遍高于正常人，部分患者出现肝脏损害，但由于入组的患者例数较少，无统计学差异。如果脑卒中患者合并高血压、糖尿病等疾病，其血管条件较差，粥样硬化的情况与发病和预后具有较强的相关性，血管粥样硬化严重的脑卒中患者，其预后往往较差。因此，对于脑卒中的高危人群，需要进行科普教育，严格低盐低脂饮食，进行系统性药物降脂和稳定血管斑块的治疗。脑卒中的研究对于预防、治疗以及预后显得尤其重要，近来，有许多学者通过研究发现，炎性相关的细胞因子作为一种重要的递质在脑卒中发生、发展及疾病的转归中起到了重要作用，它们可能影响到脑血管病的进展、严重程度及最后转归。

近些年来，在脑卒中的研究中，细胞免疫、体液免疫等免疫微环境的研究很多，炎性相关的研究逐步衍生出免疫炎性反应概念。炎症因子可以通过刺激B淋巴细胞，使其大量增殖分化，同时还可以导致单核巨噬细胞被过度激活。单核巨噬细胞在免疫反应的过程中，能够通过变形发挥吞噬抗炎作用。部分脑卒中患者的副交感神经在经过刺激后，能够呈现出过度活跃的状态。这些被激活的副交感神经能释放乙酰胆碱，发挥抑制巨噬细胞释放TNF-α，IL-6等促炎因子。在收入我院的脑卒中患者中，通过对血清炎性反应因子水平进行检测，能够发现很多对应的炎性因子分泌随之增高。例如，白细胞介素类因子升高最为明显，是目前研究最多，也是机制较为清晰的常见炎症因子。其中IL-6是炎症反应过程中的主要因子，是一种重要的炎症相关细胞因子，在脑卒中患者中发挥了重要的免疫调节作用。IL-6能够作为一种重要的递质，通过调控下游的靶向分子，在脑卒中发生、发展及疾病的转归中起到重要作用[1]。我们大胆的推测，血清中IL-6的检测可以作为一种预测病情进展和预后转归的一项重要指标，判断患者在脑卒中期间的感染情况，以及制定相应的治疗方案。在脑卒中的发生发展过程中，炎症相关细胞及因子参与其中。进一步研究发现，患者在发生脑卒中后，血液中的淋巴细胞参与其炎性介导的浸润过程，其中T淋巴细胞能够发挥促分泌作用，能够产生大量的促炎性细胞因子。这些炎症因子能够进一步促进B淋巴细胞增殖和分化。IL-6、IL-8、IL-17等炎症因子不仅能够作用于B细胞，而且还能激活单核巨噬细胞系统，促进巨噬细胞发挥吞噬作用。同时，在患者发生脑卒中后，会产生大量的坏死组织，这些组织一定程度上会释放大量的细胞因子，提高了血液循环中的含量，同时能够刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴产生冲动，而中枢神经系统的兴奋能够进一步促进交感神经系统发挥交感作用。同时脑卒中发生过程中炎症因子的变化，也会影响机体的免疫微环境，发挥正反馈作用，进一步加快炎性反应过程。上述研究结果进一步表明，脑卒中的炎性反应过程是促炎因子和抑炎因子相关作用的过程，也是一个动态平衡的过程。深入研究发现，不同卒中患者，其体内炎性反应水平存在差异。卒中病情越严重，血清炎性反应因子水平越高，动态平衡呈现促炎发展[5]。卒中病情轻微的患者，血清炎性反应因子水平越低。脑卒中患者的炎性细胞因子水平与预后是否相关需要进一步的临床观察以及实验研究。

本研究中炎性因子是主要的监测对象，其中IL-6是一种重要的炎症相关的细胞因子，其作为一种重要的递质在脑卒中发生、发展及疾病的转归中起到了重要的作用[6]，可能影响到脑血管病的病情进展、严重程度及最后的转归[3]。本研究通过分析IL-6的表达水平与ACI复发的关系。当IL-6峰值小于250pg/ml时，ACI患者1年内仅有1例复发。当IL-6峰值水平显著增高时，ACI复发的患者迅速增加，通过不同的IL-6表达水平分组，发现IL-6水平越高，复发率越高。因此我们将血清中IL-6水平作为预测病情进展和预后转归的一项重要指标，可以更好地判断患者在脑卒中期间的感染情况，以及制定相应的治疗方案。

目前研究显示，microRNAs可以单独发挥调控作用，也可以两个有着共同的作用靶点的microRNAs作为一个群体，协同发挥调控作用。目前mRNA在不同的疾病中的表达会存在差异，通过转录后水平的变化差异，调控其目的基因差异表达水平。这些microRNAs能够通过特定的途径，参与细胞分化、凋亡及增殖等机体各种生物学行为的调控。进一步的研究发现microRNAs作用十分广泛，例如microRNA-21（miR-21）在多种心血管疾病中的表达均增加，参与疾病的发生发展，并且在多种恶性肿瘤中，miR-21还能促进肿瘤细胞增殖和分化等，造成肿瘤器官内转移以及全身肿瘤细胞的扩散。急性脑梗死时，脑部的组织和细胞发生缺血缺氧反应，而后细胞坏死、凋亡，细胞膜及血脑屏障通透性增加，导致细胞中的microRNAs释放入血并能在血液中存在一段时间。miR-21在多种心血管疾病中的表达均增加，并参与了细胞增殖和分化等过程[7]。miR-21的作用机制已经有了一定的研究，研究发现miR-21可通过下调PDCD4的表达来促进细胞增殖[8，9]。另外，miR-21的过表达可以抑制正常细胞凋亡信号传导，因此抑制miR-21可促进细胞凋亡。研究发现在脑卒中的患者血清miR-21的表达明显上调，但miR-21参与脑卒中的机制仍需进一步研究。本研究显示：当miR-21/U6峰值小于30时，ACI患者1年内仅有2例复发；当miR-21/U6峰值水平显著增高时，ACI复发的患者迅速增加。通过不同的miR-21/U6表达水平分组，发现miR-21/U6水平越高，复发率越高。miR-21可能作为一种预测患者病情发展和短时间复发的重要指标。通过学习文献，我们推测miR-21在脑卒中发展过程中发挥了至关重要的作用。miR-21在一定程度上可以调控STAT3的表达[10]。进一步研究发现miR-21和IL-6的峰值越高，ACI患者复发率越高，两者趋势一致，这进一步证实miR-21通过调控STAT3来作用于IL-6的表达，两者与ACI患者的复发密切相关。

综上所述，血清中IL-6在患者炎症发生发展起到了至关重要的作用，通过对其的检测可以预测患者的卒中复发情况，为制定诊疗方法提供一定的依据，同时miR-21的检测可能为预后评估提供参照。血清IL-6和miR-21的检测或许能成为脑卒中患者的常规性的检查指标之一，为提示病情进展，制定诊疗方案，预测患者复发提供依据。