一株大黄鱼致病性溶藻弧菌的耐药性及耐药基因分析

陈洪清

(宁德市水产技术推广站,福建宁德 352100)

大黄鱼(Larimichthyscrocea)是中国主要的海水经济鱼类，福建省宁德市的大黄鱼产量占全国的80%[1]。溶藻弧菌广泛存在于海水中，溶藻弧菌病是大黄鱼的主要病害之一[2]。目前溶藻弧菌病的防控以抗菌素为主，2017年,冼钰茵等[3]对从广州市出售水产品中分离得到的87株副溶血弧菌和118株溶藻弧菌的耐药性分析结果表明，水产动物的主要病原菌的副溶血弧菌和溶藻弧菌对万古霉素等抗生素有明显抗性，多重耐药比例达100%，溶藻弧菌的多重耐受现象较为突出。病原菌耐药性的产生与盲目地大量使用抗菌素有关。由于病原菌普遍存在耐药性，因此有必要对病原菌进行耐药性分析，以达到精准用药、科学用药的目的。

笔者于2018年用TCBS和TSA培养基从表现出体表和鳍条溃疡、出血、鳃缺损症状的患病大黄鱼上分离得到一株优势菌，该菌株可在TCBS培养基上生长，菌落颜色为黄色；生理生化鉴定结果与溶藻弧菌一致，16SrDNA分析结果表明该菌与溶藻弧菌的同源率为99%，证实该菌为溶藻弧菌，命名为Val180620。攻毒结果显示：Val180620菌株对大黄鱼具有较强的致病力，在水温25℃时腹腔注射感染，其对规格(20±2)g的大黄鱼的LD50为2.38×106CFU(另文发表)。采用纸片扩散法(K-B法)和倍比稀释法检测了该菌的耐药性，并对相关的耐药性基因进行了分析，以期了解该菌的耐药性情况，为溶藻弧菌病的科学防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

溶藻弧菌Val180620分离自表现出体表溃疡等症状的大黄鱼，保藏于-80℃。TSA培养平板和TSB培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。磺胺甲噁唑、氟苯尼考、盐酸多西环素、红霉素、盐酸环丙沙星、土霉素、恩诺沙星、硫酸新霉素、氨苄西林钠购自Sigma公司，用于纸片扩散法的药敏片来源于温州市康泰生物科技有限公司[4-7]。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养

将溶藻弧菌Val180620接种于TSA培养基上，28℃培养24 h后，用接种环挑取单菌落，接种于10 mL TSB培养液，150 rpm震荡培养24 h，平板计数法计数, 用TSB培养液将菌液稀释到2×106CFU·mL-1备用。

1.2.2 纸片扩散法

在超净工作台中用移液器吸取700 μL浓度为2×106CFU·mL-1的菌液，均匀涂布于TSA平板上，5 min后，将药敏片贴于平板上，于28℃静置培养24 h后观察。各含药纸片的药物含量如表1所示。

1.2.3 倍比稀释法

按表2配置药品溶液，配制9种药物的母液初始浓度为2 048 μg·mL-1。在超净工作台中，将药物于96孔细胞培养板中使用灭菌TSB肉汤以2n进行倍比梯度稀释，共计12个稀释度。各药物的起始浓度均为1 024 μg·mL-1，配好的药物最终浓度分别为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1，每孔药液体积为120 μL。再往96孔细胞板内加入与药液等体积，浓度为2×106CFU·mL-1的菌液，于28℃静置培养24 h，观察试验结果，无菌生长的最低药物浓度即为抑制细菌生长的最低浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。取MIC孔前3个稀释度的培养液各100 μL，涂布于TSA培养基上，于28℃静置培养24 h，无菌生长的最低药物浓度判定为最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)。

1.2.4 耐药基因的PCR检测

根据文献报道耐药基因引物序列(表3)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。从TSA平板挑取单菌落，接种于TSB培养基，于28 ℃继续培养24 h后，收集菌体，按照OMEGA细菌DNA提取试剂盒方法提取菌体DNA作为PCR模板，PCR体系为：Premix Taq(Ex Taq Version 2.0 plus dye)25 μL，菌DNA模板 1 μL，上游引物(10 μM)2 μL，下游引物(10 μM)2 μL，灭菌水 20 μL。PCR反应条件95℃ 3 min；94℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72℃ 40 s 34个循环；72℃ 7 min。反应完成后对PCR产物进行2%琼脂糖电泳检测，观察结果。

2 结果与分析

2.1 纸片扩散法

以纸片扩散法(K-B法)测定菌株Val180620对9种药物的敏感性结果见表4。参照 CLSI标准[8]可以得知，菌株对氨苄西林钠耐药，对氟苯尼考、磺胺甲噁唑高度敏感。

表1 药敏纸片含药量Tab.1 Drug content in drug sensitive slips

表2 各药物稀释所用的稀释液Tab.2 Diluents used for drug dilution

注：A:无菌水；B:蒸馏水；C:90%丙二醇；D:90%甲醇；E:pH为8的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液；F：pH为6的0.1 mol·L-1磷酸缓冲液；G：2.5 mol·L-1NaOH；H:95%乙醇

Note: A：aquae sterilisata; B: DD H2O; C:90% propylene glycol; D: 90% CH3OH; E: pH 8，0.1 mol·L-1phosphate buffer; F: pH 6.0，0.1 mol·L-1phosphate buffer; G: 2.5 mol·L-1NaOH; H: 95% CH3CH2OH

2.2 倍比稀释法

按CLSI(2010)，由表5可知，恩诺沙星、土霉素、硫酸新霉素、磺胺甲噁唑、氟苯尼考对菌株Val180620有较好的抑菌和杀菌效果，盐酸多西环素、红霉素抑菌和杀菌效果较差。

2.3 耐药性基因检测

耐药性基因PCR产物电泳检测结果显示，β-内酰胺类耐药性基因blaCTX-M和喹诺酮类耐药基因qnrVC扩增片段大小与目标基因一致。qnrVC5以及四环素类耐药基因tetS、tetM扩增片段大小与目标基因相比有差异(见图1)，将片段回收后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序结果表明分离菌株含有耐药基因blaCTX-M和qnrVC。

表4 菌株Val180620对9种药物敏感试验结果Tab.4 Sensitivity of strain Val180620 to 9 kinds of antibiotics

注：S表示敏感，R表示耐药

Note: S is sensitive, R is resistant

表5 菌株Val180620对9种药物的MIC和MBCTab.5 MIC and MBC of strain Val180620 to 9 kinds of antibiotics

注：按照 CLSI标准，MIC值和MBC值大于16为耐药

Note: According to CLSI standards, MIC and MBC values more than 16 are resistant

3 结果与讨论

溶藻弧菌广泛存在于海水中，可危害鱼、虾、贝等多种水产经济动物[9]。目前水产养殖鱼类的细菌病防控仍以抗菌素等药物为主，养殖户用药多凭经验，存在一定的盲目性，所使用的药物常不能得到理想的治疗效果，不仅延误了病情，同时加重了药物残留，因此有必要检测病原菌的耐药性，为精准用药提供依据。

纸片扩散法结果表明，来自大黄鱼的致病溶藻弧菌对氟苯尼考、磺胺甲噁唑等药物高度敏感，对喹诺酮类药物恩诺沙星、盐酸环丙沙星，四环素类药物盐酸多西环素、土霉素，大环内酯类药物红霉素等敏感，而对β-内酰胺类药物氨苄西林钠等耐药。氟苯尼考、盐磺胺甲噁唑、氨苄西林钠等药物MIC和MBC实验结果与纸片法基本一致，但四环素类药物盐酸多西环素、大环内酯类药物红霉素MIC和MBC结果与纸片扩散法不一致。据报道，在未加入稳定剂的情况下，盐酸多西环素、红霉素水溶液的稳定性较差[10-11]，推测本研究中盐酸多西环素、红霉素的MIC和MBC的试验结果与纸片法的试验结果存在差异，与盐酸多西环素和红霉素水溶液的稳定性差有关。

水产常用药氨苄西林钠属于β-内酰胺类药物，恩诺沙星、盐酸环丙沙星属于喹诺酮类药物，盐酸多西环素、土霉素属于四环素类药物，为了进一步分析菌株耐药的内在原因，本研究进一步检测了菌株β-内酰胺类耐药性基因blaCTX-M，喹诺酮类耐药基因qnrVC、qnrVC5以及四环素类耐药基因tetS、tetM的携带情况，结果显示菌株Val180620同时携带有blaCTX-M和qnrVC这两种耐药基因。虽然携带喹诺酮类耐药基因qnrVC，但菌株Val180620却对喹诺酮类药物恩诺沙星和盐酸环丙沙星敏感。推测该基因可能不是喹诺酮类药物恩诺沙星和盐酸环丙沙星的唯一决定性耐药基因，有必要对更多的耐药相关基因进行检测和测序分析。

韩风杰等[12]发现山东地区魁蚶中的溶藻弧菌对氨苄西林钠表现出较强的敏感性，胡梦华等[13]从发病虾中分离的一株溶藻弧菌对磺胺甲噁唑具有一定的耐药性，与本研究的结果不一致，说明不同环境条件、不同养殖方式、不同宿主上得到的溶藻弧菌对药物的敏感性存在差异。因此在防治溶藻弧菌病时使用抗菌药，不应仅凭经验或照搬书本，而应进行药敏检测，根据药敏检测结果选择合适的药物，以达到精准用药、科学用药的目的。