阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征外周血miR-223、MMP-9的表达及意义

李琳 金鹏 刘亚

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(Obstrutive Sleep Apnea-Hypopnea Syndrome,OSAHS)是临床上的常见病。早期症状主要为打鼾，随着病情发展，夜间睡觉会出现呼吸暂停、间断性缺氧，这些症状将直接影响血流动力学及心血管损害，严重影响患者生活质量及生命健康[1]。目前临床上对OSAHS的诊断主要依靠患者的临床表现和多导睡眠监测结果进行评估，常因各种外在因素影响，致使其诊断受限。睡眠中发生“呼吸暂停-间断缺氧”的过程与“缺血-再灌注”过程相似，其反复间断缺氧会促进血浆内的炎性因子释放[2]。而血液中含有丰富的miRNA，其中微小分子miR-223是表达量较高且研究较多一种。有研究证明，miRNA能够调控循环中单个核细胞、巨噬细胞的活性，减少血液中炎性因子的产生[3]。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)作为一种蛋白水解酶，属于炎性因子之一。因此，了解OSAHS患者外周血miR-223及MMP-9表达水平，可能对OSAHS的诊治有一定指导价值。本研究探讨OSAHS患者的外周血miR-223、MMP-9的表达水平，旨为OSAHS的诊治提供一种新的思路，现报道如下。

资料与方法

一、研究对象

选取2017年1月至2018年12月在我院收治的OSAHS患者作为研究对象，纳入标准：(1)临床资料完整；(2)年龄≥18岁；(3)疾病组符合《阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊治指南(2011年修订版)》[4]的诊断标准；(4)所有入组对象均对本研究内容知情，且自愿签署知情同意书。排除标准：(1)伴有哮喘、风湿疾病、严重心律失常者；(2)伴有严重高血压者；(3)伴有凝血功能障碍；(4)合并心、肝、肾等严重系统性疾病者；(5)合并感染性疾病者；(6)近三个月内有创伤及手术史。符合上述标准的患者共有50例，并将其纳入观察组，其中男性37例，女性13例，年龄20～59岁，平均年龄(41.67±7.62)岁；根据观察组患者的睡眠呼吸暂停低通气指数(AHI)数值分为轻度17例(AHI≤10次/h)、中度22例(10次/h20次/h)。以同期健康体检的健康者50例作为对照组，其中男性35例，女性15例，年龄21～59岁，平均年龄(40.51±8.61)岁。两组性别、年龄等基线资料对比，差异无统计学意义(P>0.05)，(见表1)，具有可比性。本研究已经我院伦理委员会批准同意。

表1 观察组与对照组的基线资料对比

二、方法

1 样本收集 分别于早晨(7:00～9:00)时间段，在无菌条件下，抽取观察组患者的空腹静脉血5 mL，在健康体检当日抽取对照组空腹静脉血5 mL，置于EDTA抗凝管内，并在20min内，以3000r/min离心15～20min，提取血清到EP管内，EP管口标识样本的名称、编号。置于-80℃低温冰箱内保存待测。离心仪器(生产厂家：北京雷勃尔离心机有限公司，型号：LDZ5-2)。

2 外周血miR-223表达量测定 总RNA提取：将超低温冰箱中血清标本取出，采用TRIzol试剂提取血清中的总RNA，取1微升，采用紫外分光光度计检测RNA的浓度、纯度。在提取过程中用到的器械及耗材均经高温及水浸泡消除RNA酶。miRNA逆转录反应：miR-223逆转录反应试剂均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司的TaqMan miRNA试剂盒。miR-223上游引物：5′-CAGAAAGCCCAATTCCATCT-3′；下游引物：5′-GGGCAAATGGATACCATCC-3′； 采用荧光定量PCR法检测，内参为U6RNA，40个循环(95℃ 1min、60℃1min、72℃1min)延伸72℃(7min)。根据公式2-△△CT分别计算miR-223的相对表达量。

3 外周血MMP-9表达水平测定 将超低温冰箱中血清标本取出，采用酶联免疫吸附法检测血清中的MMP-9表达水平，所用试剂盒购自武汉伊莱瑞特公司，检测者按照试剂盒操作步骤进行加样，采用酶标仪在450mm波长下测定OD值，在标准曲线绘制软件下完成绘制曲线，并计算出MMP-9表达水平。

4 观察指标 (1)对比分析对照组和观察组的miR-223相对表达量及MMP-9表达水平间的差异。(2)观察OSAHS不同病情程度的miR-223、MMP-9表达情况，并分析miR-223相对表达量及MMP-9表达水平在预测OSAHS病情程度的特异性和敏感度。

三、统计学分析

应用SPSS21.0软件对本次研究数据进行处理。其中计量资料比较，采用成组设计的t检验或F方差分析,多组之间两两比较采用SNK-Q检验的方法；通过ROC曲线下面积(area under the cure,AUC)评价miR-223相对表达量及MMP-9表达水平的诊断效能。设检验水准α=0.05，以P<0.05代表有统计学意义。

结 果

一、观察组和对照组的外周血miR-223、MMP-9表达对比

观察组患者的外周血miR-223相对表达量明显低于对照组，而MMP-9表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

二、不同OSAHS病情程度的miR-223、MMP-9表达水平对比

OSAHS患者病情轻度、中度及重度的miR-223相对表达量及MMP-9表达水平对比，差异有统计学意义(P<0.05)。进行两两比较中度、重度的miR-223相对表达量均低于轻度，差异有统计学意义(P<0.05)，重度miR-223相对表达量低于中度，差异有统计学意义(P<0.05)。中度、重度的MMP-9表达水平均高于轻度，差异有统计学意义(P<0.05)，重度的MMP-9表达水平高于中度，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

表2 观察组和对照组的外周血miR-223、MMP-9表达对比

表3 不同OSAHS病情程度的miR-223、MMP-9表达水平对比

注：*表示与轻度对比，P<0.05；#表示与中度对比，P<0.05。

三、外周血miR-223、MMP-9表达水平在预测OSAHS病情程度的ROC曲线分析

外周血miR-223相对表达量及MMP-9表达水平在预测OSAHS病情程度的AUC面积为：miR-223(0.696)、MMP-9(0.832)(见图1，表3)。

图1 外周血miR-223相对表达量及MMP-9表达水平在预测OSAHS病情程度的ROC曲线分析

表4 miR-223相对表达量及MMP-9水平的ROC曲线分析结果

讨 论

OSAHS属于一种慢性睡眠呼吸障碍疾病，其发病机制尚未阐明。目前临床上普遍认为是患者在夜间睡眠时因舌根后坠等原因引起上呼吸道阻塞、狭窄，致使呼吸减弱或呼吸暂停，出现缺氧，夜间被憋醒，睡眠中断[5-8]。而反复的出现呼吸气息减弱或呼吸暂停，会发生间歇性的高碳酸血症和低氧血症，继而诱发机体发生相关的病理改变，进而导致晨起头痛、白天嗜睡、疲累、乏力、性欲下降、记忆力减退等症状，对患者的生命质量造成严重影响。由于现阶段OSAHS缺乏有效的生物学标志物[9]。寻找能够准确评估OSAHS病情的特异指标，对其进行早期防治具有意义重大。

微小miRNA是一类高度保守的内源性非编码微小RNA分子,长度约有18～22个核苷酸。miRNA可通过与靶基因3′端非编码区碱基区域的miRNA调节元件结合，引起靶mRNA降解或抑制其翻译。从而对基因进行转录调控[10]。因此，循环miRNA也被认为在诸多病理过程中发挥重要作用，如免疫炎症、心脑血管疾病、癌症等[11-13]。微小分子miR-223是miRNA家族中的一员，位于X染色体的q12基因组内，能够作用于众多靶基因，调节免疫炎症反应。有研究证实，miR-223能够调节循环中单个核细胞、巨噬细胞的活性，减少血清中的炎性因子释放[14]。有大量实验证实了miR-223可作用于靶基因TRAF6、TAB1、Cul1a/B控制细胞中的NF-κB通路，阻断炎症因子反应[15-18]。而OSAHS患者常反复表现“呼吸暂停-间断缺氧”，这一过程恰好是会促进血粘度的增加、血管受损，从而引起血清内的炎性因子大幅增加[19-20]。其中MMP-9属于基质金属蛋白酶家族成员，是一个重要的炎性因子。因此，血浆中MMP-9异常增加可能与OSAHS患者外周血循环中巨噬细胞激活有关。本研究发现，观察组的血清miR-223相对表达量明显低于对照组，而MMP-9表达水平明显高于对照组(P<0.05)；OSAHS患者病情轻度、中度及重度的miR-223相对表达量呈依次降低，MMP-9浓度呈依次升高。其原因分析：(1)OSAHS患者反复间断性缺氧与复氧，导致ROX系统被激活，进而引起炎症反应、氧化应激，从而造成血管内壁损伤，高脂血症；脂质可迫使病变部位的巨噬细胞分泌脂蛋白酶，而内膜巨噬细胞表面的清道夫受体与低密度脂蛋白结合，形成泡沫细胞分泌MMP-9,MMP-9的启动可使血管平滑肌细胞增加、迁移，从而导致外周血MMP-9表达水平上调。(2)外周血miR-223低表达可能与其在调节促炎活化功能和抑制脂质刺激启动信号传导时受阻有关。OSAHS患者外周血的IL-6、hs-CRP表达水平与AHI呈正相关[21]，而IL-6被认为是导致miRNA-223低表达的主要分子之一[22]， miRNA-223低表达状态时会调节受体，如Toll样受体触发的免疫反应，又会诱导巨核细胞产生并分泌IL-6[23]，如此循环，进而OSAHS患者症状越严重，表现出miRNA-223水平进一步下调。可见，miRNA-223的表达水平与OSAHS患者症状严重程度相关。通过ROC曲线进一步分析miR-223、MMP-9在预测OSAHS病情程度的特异性和灵敏度。结果发现外周血miR-223相对表量及MMP-9表达水平在预测OSAHS病情程度的AUC面积为：miR-223(0.696)、MMP-9(0.832)。以最大约登指数计算出miR-223及MMP-9最大AUC面积相应的截断值，其中miR-223截断值为0.637(敏感度=73.30%，特异性=84.70%)，MMP-9截断值为2297.323 ng/L(敏感度=86.20%，特异性=91.30%)。这可能是OSAHS患者在反复间断性缺氧与复氧的症状下，导致血液粘度增加，刺激巨噬细胞大幅释放MMP-9炎性因子，致使MMP-9的特异性较强。由于血清检测具有取材方便、无创伤、重复性强等优点。提示血清miR-223及MMP-9表达水平可作为OSAHS患者病情辅助诊断标志物。

综上所述，OSAHS患者外周血miR-223呈低表达状态，MMP-9呈高表达状态，与患者病情严重程度密切相关。