高效液相色谱法测定盐酸左氧氟沙星眼用凝胶含量

付 欢 ，龚明峰 ，王 超

（1.湖北远大天天明制药有限公司，湖北 武汉 430050；2.远大医药（中国）有限公司，湖北 武汉 430050）

盐酸左氧氟沙星为氧氟沙星的左旋体，属于经典的喹诺酮类药物，对大肠埃希菌、克雷白菌属、枸橼酸杆菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、沙雷菌属、变形杆菌、支原体及衣原体的感染具有较好治疗作用[1,2]，利用其抗菌特性制备的眼用凝胶，不仅可改善相关滴眼液在眼内滞留时间短和生物利用度小等问题，同时也避免相关软膏剂引起的眼表油腻感与视力模糊[3,4]，因而对其主药含量检测方法的研究意义重大。

目前，国家标准采用紫外吸收光谱法测定盐酸左氧氟沙星眼用凝胶的主药含量[5]，但该方法专属性存在不足，无法有效避免同波长下共存物质的干扰，而左氧氟沙星目前已被中国药典2015版二部、美国药典和欧洲药典收载，均规定采用高效液相色谱法检测[6-8]。因此，本研究利用上述方法原理，建立高效液相色谱法测定盐酸左氧氟沙星眼用凝胶含量的分析方法，并进行方法学验证，为相关产品的质量标准提升提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

U3000型高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）；Chromeleon 7.2液相色谱工作站（赛默飞世尔科技有限公司）；万分之一精密分析天平（梅特勒-托利多精密仪器有限公司）；离心机、pH计（梅特勒-托利多精密仪器有限公司）；KQ-100B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

HCl、NH3·H2O、NH4Ac、NaClO4、H3PO4、乙腈均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；左氧氟沙星对照品（中国食品药品检定研究院，批号：130455-201607，含量97.3%）；左氧氟沙星杂质E（中国食品药品检定研究院，批号：130616-201302，含量100.0%）；环丙沙星（中国食品药品检定研究院，批号：130451-201203，含量 100.0%）；盐酸左氧氟沙星眼用凝胶（规格：5g:0.015g，湖北远大天天明制药有限公司），试验用水为去离子水。

1.2 色谱条件

Acclaim 120 C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）；流动相：乙腈-水（取NH4Ac 4.0g和NaClO47.0g，加水1300mL溶解后，用H3PO4调节pH值至2.2）=15∶85；流速：1.0mL·min-1；检测波长：294nm；柱温：室温；进样量：10μL。

1.3 溶液配制

1.3.1 系统适用性溶液 称取左氧氟沙星对照品、环丙沙星对照品和杂质E对照品各适量，加0.1mol·L-1HCl溶液溶解并稀释制成每1mL中约含左氧氟沙星0.1mg、环丙沙星和杂质E各5μg的混合溶液。

1.3.2 对照溶液 分别称取左氧氟沙星对照品适量，精密称定，加适量甲醇溶解后，加0.1mol·L-1HCl溶液稀释成每1mL中含左氧氟沙星0.1mg的对照溶液，平行配制两份。

1.3.3 供试品溶液 取本品适量，精密称定，加0.1mol·L-1HCl溶液溶解，稀释制成每1mL中约含左氧氟沙星（按C18H20FN3O4计）0.1mg溶液后，离心（3000r·min-1）15min，取上清液作为供试品溶液。

1.3.4 空白辅料溶液 按照实际药品处方用量，配制不加原料的空白辅料溶液后，照1.3.3所述步骤稀释、离心后，取上清液，即为空白辅料溶液。

2 结果与讨论

2.1 系统适应性与专属性

分别取空白、对照和供试品溶液在“1.2项色谱条件下”进样，记录色谱图，见图1。

图1 液相色谱图Fig.1 Chromatograms of system suitability（A）,blank auxiliary material solution（B）, reference substance solution（C）and sample solution（D）

从图1可知，左氧氟沙星出峰时间为17.3min，理论塔板数超过3000，且左氧氟沙星与杂质E峰和与环丙沙星峰之间的分离度均大于2.0，空白辅料溶液不干扰结果测定，因此，该色谱系统的适用性与专属性均较好。

2.2 稳定性

在“1.2 项色谱条件下”，分别于 0、2、4、8、12、24h进样，平行3次，记录盐酸左氧氟沙星与羟苯甲酯峰面积，测定其含量，结果见表1。

表1 供试品溶液稳定性Tab.1 Stability of sample solution

从表1可见，不同时间段下，样品中左氧氟沙含量结果RSD＜1.0%，表明供试品溶液在配制后24h内，盐酸左氧氟沙星含量均一、稳定。

2.3 线性关系考察

取左氧氟沙星对照品适量，加入0.1mol·L-1HCl配制成每1mL约含1mg·mL-1的左氧氟沙星溶液，作为对照品储备溶液。分别精密量取上述储备液 3、2、5、3、4mL 至 50、25、50、25、25mL 容量瓶内，加入0.1mol·L-1HCl稀释至刻度摇匀，制成左氧氟沙星标准系列溶液。照“1.2项色谱条件”，分别进样10μL后，记录色谱峰面积，以进样溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到左氧氟沙星线性方程为：Y=817.4x+0.61（r=0.9999），表明样品中左氧氟沙星浓度在60～160μg·mL-1范围内，线性关系良好。

2.4 中间精密度

选择不同试验人员在不同时间下，照“1.2项色谱条件”进样，以考察该分析方法在不同试验环境下的结果重复性，具体见表2。

表2 不同试验人员在不同时间的测定结果（n=6）Tab.2 Measuring results of different member in different time（n=6）

从表2结果可知，不同试验人员在不同试验环境下对同一样品的测定结果相对标准偏差均低于1.0%，表明具有较好的中间精密度，因而有利于该分析方法在不同实验室的应用。

2.5 回收率

精密称取样品9份，分别各加入3份已知左氧氟沙星含量80%、100%、120%的对照品，采用0.1mol·L-1盐酸溶液配制成低、中、高3个质量浓度的样品溶液，每个质量浓度3份。照“1.2项色谱条件”进样，记录色谱峰面积，计算回收率，结果见表3。

表3 盐酸左氧氟沙星回收率测定结果（n=3）Tab.3 Recovery of levofloxacin hydrochloride determination（n=3）

从表3可知，加入不同质量浓度对照品的样品溶液，计算结果回收率均在100.0%～102.0%之间，且RSD均低于2.0%，表明该方法测定结果具有较好的准确度。

2.6 不同分析方法比较

分别采用液相色谱法与紫外分光光度法测定3种不同批号样品的左氧氟沙星含量，结果见表4。

表4 不同方法测定结果比较（n=6）Tab.4 Comparison of results bydifferent methods（n=6）

从表4结果可知，高效液相色谱法测定结果与国标方法较为接近，最大仅相差1.8g·mol-1。在95%的置信度下，对两组数据进行t检验，计算所得t值均明显低于置信因子（2.57），表明两种分析方法结果间不存在显著性差异[9]。

3 结论

本文采用高效液相色谱法测定盐酸左氧氟沙星眼用凝胶含量，具体色谱条件为：色谱柱为C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-水（取NH4Ac 4.0g和NaClO47.0g，加水 1300mL溶解后，用H3PO4调节 pH 值至 2.2）=15∶85，流速 1.0mL·min-1，柱温为室温，检测波长为294nm。在该条件下，盐酸左氧氟沙星含量测定结果具有较好的精密度与准确度，同时该方法操作过程简便、快速，因而可满足相关产品的分析检测要求。