一株高效异养脱硫菌的筛选及性能研究*

佟欣宇 ，李海红 ，宦臣臣 ，闫志英

（1.西安工程大学 环境与化学工程学院，陕西 西安 710048；2.中国科学院 成都生物研究所，四川 成都 610000）

随着近年来资源化利用的迅速发展，堆肥过程中产生的恶臭气体作为二次污染得到的越来越多的关注[1]。其中含有H2S的废气由于毒性较强且具有腐蚀性，严重危害人类健康和设施安全[2]。目前，处理这类污染物常见的方法有物理、化学和生物法。生物脱硫法是利用微生物所含酶系将含硫化合物转化成单质硫或硫酸盐，因其设备简单，处理费用低，反应温和，以及环保无二次污染等优点成为现如今脱硫方向的研究热点[3,4]。

目前，已报道的可用于生物脱硫的微生物种类繁多，但大部分是光能自养型微生物[5-8]。这类微生物脱硫效果显著，但因其生长速率缓慢且生存环境要求较苛刻而不适应于大型反应器的培养挂膜[9]，而有机异养型微生物可以弥补这些问题。因此筛选具有高效脱硫能力的异养微生物，并探究其脱硫特性便显示的尤为重要。本研究从硝化池活性污泥中筛选一株高效异养脱硫菌，探究其对去除溶液中硫化物的最佳反应条件及对气态H2S的去除效率，以期为生物脱硫的实际应用提供参考。

1 实验部分

1.1 菌株来源

本实验菌株均筛选自四川省成都市长安垃圾填埋场的垃圾渗滤液硝化池活性污泥中。

1.2 培养基

（1）富集和脱硫实验培养基 葡萄糖5.0g；KH2PO41.0g；K2HPO41.0g；MgCl2·6H2O 0.8g；FeCl2·12H2O 0.01g；NH4Cl 0.4g；NaHS 5.0g，蒸馏水 1000mL，pH 值为 6.8～7.2，115℃灭菌 30min。

（2）LB培养基 酵母提取物5.0g；蛋白胨10.0g；NaCl 10.0g；蒸馏水 1000mL，pH 值为 7.0，121℃灭菌30min。

1.3 菌株的筛选

取10mL活性污泥于装有90mL富集培养基的锥形瓶中，在30℃，160r·min-1的恒温摇床下培养24h，静止取10mL上清液于新的分离培养基中，如此反复5次。最后一次富集后，取上清液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7浓度梯度稀释，分别取0.2mL稀释液于固体分离培养基上进行涂布并培养数天。将培养基中形态和样貌不一的单菌落分离纯化，并进行斜面保存。

将筛选出的菌株按照10%的接种量接入已灭菌的脱硫实验培养基中，于30℃，160r·min-1的恒温摇床中培养。每一株分别设定3个平行和3个空白作为对照，每隔0.5h取样并离心，测定其上清液中硫化物浓度以及沉淀中的硫单质浓度，并以此作为判断标准筛选出脱硫效果最佳的菌株。

1.4 菌株鉴定

1.4.1 菌株生理生化及分子生物学鉴定 参照《伯杰明细菌鉴定手册》进行革兰氏染色、氧化酶、接触酶等生理生化试验。以及在电子显微镜下观察其细胞形态。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株AS-2的基因组DNA，以此为模板，利用16S rDNA基因通用引物，进行PCR扩增。扩增16SrDNA的引物:27F（正向）（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（反向）（5'-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3'）。将扩增好的PCR产物送至上海生物工程股份有限公司进行16S rDNA鉴定。测得的序列通过NCBI中Blast程序与Genbank中核酸数据进行比对分析，使用MEGA6.0软件绘制菌株进化发育树。

1.4.2 生长曲线测定 采用自动生长曲线仪Bioscreen C仪器测定菌株AS-2的生长曲线。以1%的接种量将其接种至LB培养基，混合均匀后取200μL于96孔板，并设置10个平行组。设置在环境温度30℃，中等转速下，每隔30min对波长λ=600nm处的吸光光度值进行测量。

1.5 脱硫条件优化实验

在控制其他条件不变的情况下，分别选取不同初始 pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、不同温度（24、27、30、33、36℃）、 不 同 转 速（120、140、160、180、200r·min-1）和不同接种量（1%、3%、5%、7%、9%）为变量设计单因素实验探究菌株AS-2脱硫效率的最佳条件。通过对培养基中硫化物、硫酸盐及硫单质的浓度计算去除率。

1.6 对H2S气体的去除效果

将150mL培养基加入500mL厌氧瓶中，并向厌氧瓶中充入500×106的H2S气体，最后将富集24h的菌液按照3%的接种量接入培养基中，与33℃，160r·min-1的恒温摇床中培养 24h。每隔 4h 取样测定空白组与实验组瓶中剩余的H2S浓度，评价菌株AS-2去除H2S气体的能力。检测方法采用便携式仪器复合式气体检测仪来确定，检测范围为0～500×106，分辨率为 0.01%。

1.7 检测和分析方法

硫化物的测定方法采用亚甲基蓝分光光度法（λ=650nm）；单质硫的测定方法采用四氯化碳萃取-高效液相色谱（HPLC）[10]法（λ=240nm）对离心后的沉淀物进行检测；硫酸盐的测量方法采用哈希DR2800便携式分光光度计，使用SulfaVer 4试剂粉包法进行测量。

2 结果与讨论

2.1 脱硫菌株的筛选

本实验共筛得3株具有脱硫能力的株。经过16S rDNA测序及生理生化实验（结果见表1），对比《伯杰明细菌鉴定手册》得出这三株菌分别为：脱氮副球菌（Paracoccusdenitrificans）AS-1，巴利阿里假单胞菌（Pseudomonas balearica）AS-2，和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）AS-3。

对筛选出的3株脱硫菌进行脱硫效果验证实验，结合各自的硫化物降解率和单质硫转化率，对比选出脱硫效果最佳的一株作为后续探究实验的目标菌株。图1为各菌株在实验过程中硫化物及单质硫浓度的变化规律。

表1 菌株的生理生化实验结果Tab.1 Physiological and biochemical reaction of heterotrophic strains

图1 各菌株脱硫过程各离子浓度变化Fig.1 Changes in ion concentration during desulfurization of strains

从图1可以发现，菌株TS-1将初始浓度为632.83mg·L-1的硫化物在5h时去除完全，其中0～2h菌株AS-1对硫化物的去除速率达到最大可达217.43mg·（L·h）-1，同时菌株 AS-1 在 3h 时单质硫的浓度达到最大值，为357.18mg·L-1，此时的最大单质硫生成率为56.44%。菌株AS-2最大硫化物去除速率略低于 AS-1，但也达到了 210.64mg·（L·h）-1，并且在4.5h时将硫化物全部去除；AS-2在3h时达到的最大单质硫生成率为60.80%，此时浓度为390.48mg·L-1，明显高于 AS-1。菌株 AS-3 的硫化物去除速率仅为 195.17mg·（L·h）-1，且在 5.5h 时去除率才达到100%；单质硫的最大浓度为321.59mg·L-1，最大生成速率为52.00%，为3株菌中最低。除此以外，空白实验组培养基中硫化物在5h时的去除率仅为30.23%，且单质硫浓度不超过89.34mg·L-1，对比说明各菌株的脱硫能力显著。

综上所述，本文选取具有最大单质硫生成率的AS-2作为实验目标菌株。根据OD600与时间的关系绘制其生长曲线，如图2（a）所示；并对其进行扫描电镜实验观察其具体形貌特征如图2（b）所示，以及图2（c）所示对其培养基内剩余固体物质进行扫描电镜实验确定单质硫的形态学特征。

从图2（a）可看出，0～24h为菌株的生长对数期，24～68h为短暂的静止期，随后开始进入衰亡期。扫描电镜显示菌株AS-2呈短杆状，其单菌长约463nm，宽1.11μm。对菌株脱硫产物进行扫描电镜实验可观察到有明显的多面体菱形小块，表面杂志较多，呈凹凸不平状[11]，经能谱分析测的其含有较多的S、C和O元素，证明除单质硫外菌株在脱硫过程中还生成了其他物质，可能在硫化物浓度较低时，菌株会将单质硫继续氧化成更高价态的硫形式，如硫酸盐等。

图2 菌株AS-2及其脱硫产物的形态特征Fig.2 Morphological characteristics of strain AS-2 and its desulfurization products

2.2 菌株脱硫条件优化

根据之前的实验发现，菌株在初始浓度为650mg·L-1的培养基中，3h时单质硫的生成率最高。因此，后续实验中均以3h的单质硫生成率和最终产物硫酸盐转化率作为评价最佳脱硫条件的依据。

2.2.1 不同初始pH值 如图3（a）所示为菌株AS-2在不同初始pH值条件下的脱硫效率及生长情况。由于酸性环境会抑制菌株细胞的生长，因此，在初始pH值为5.0和6.0时菌株AS-2的OD600值较低，导致其脱硫效率也较低；当初始pH值为中性或弱碱性时，菌株AS-2的OD600值明显升高，尤其是初始pH值为7.0时，具有最高的单质硫生成率和硫酸盐转化率，说明中性环境更适于累计单质硫，促进硫酸盐的转化，该结论与林旭等人筛选的硫氧化细菌结论一致[12]。综上所述选择7.0为最佳初始pH值条件。

2.2.2 不同接种量 如图3（b）所示为菌株AS-2不同接种量条件下的脱硫效率及生长情况。从图中可以看出，随着接种量由1%增加至7%，菌株的OD600值逐渐升高，当接种量继续增加时菌株的OD600值反而降低。其中，当接种量为3%时菌株AS-2的单质硫生成率和硫酸盐转化率为最大。原因可能是较低的接种量导致菌体数量过低，不利于对硫化物的高效降解；而过高的接种量会导致菌株之间相互竞争，营养物含量不足，从而降低菌株的脱硫效率。综上所述选择3%为最佳接种量条件。

2.2.3 不同转速 如图3（c）所示为菌株AS-2在不同转速条件下的脱硫效率及生长情况。

由图3（c）可知转速对菌体的生长繁殖情况并没有明显的影响，当转速为140r·min-1和160r·min-1时菌株的OD600值略高于其他。其中当转速为160r·min-1时菌株具有较高的单质硫生成率和硫酸盐转化率，原因可能是该转速条件下氧气的溶解和传质过程较为均衡[13]。随着转速的提升单质硫的生成率和硫酸盐的转化率均开始降低，但硫酸盐的下降幅度大于单质硫，原因可能为较高的转速降低了氧气的溶解度，使培养基内氧含量降低。综上所述选择160r·min-1为最佳转速条件。

2.2.4 不同温度 如图3（d）所示为菌株AS-2在不同培养温度条件下的脱硫效率及生长情况。

由图3（d）可知，培养温度对菌株OD600的影响较低，说明菌株AS-2在24～36℃间均可稳定生长繁殖。当温度为33℃时培养基中测得的单质硫生成率高达72.13%。原因可能是33℃条件下不仅促进了菌株AS-2的生长代谢，同时使菌株体内的脱硫酶活性达到最大，从而提高了生物脱硫的反应速率。综上所述选择33℃为最佳培养温度条件。

图3 菌株AS-2单因素实验结果Fig.3 Single factor experiment results of strain AS-2

2.3 对H2S去除效果实验

根据单因素实验得出的最佳脱硫条件，设计实验验证菌株AS-2对H2S气体的去除能力。结果见图7。

图4 菌株对H2S气体的去除能力Fig.4 Ability of the strain to remove H2S gas

由图4可知，接入菌株AS-2的实验组将初始浓度约为500×10-6的H2S气体在 24h时降低至17.23×10-6，去除率为96.55%。对比无菌的空白组24h时去除率仅为11.70%。原因可能是生物脱硫时，H2S气体首先经历了由气相转入液相的过程，溶于液体的H2S气体在接触到脱硫菌后，再次被菌株吸收氧化[13]。因此，空白对照组中H2S气体浓度的减少，是因为少量的H2S气体溶于培养基，而并非被彻底去除。综上所述可见菌株AS-2不仅可高效去除溶液中的硫化物，同样具有较强的去除H2S气体的能力。

3 结论

（1）从成都长安垃圾填埋场的垃圾渗滤液硝化池中分离纯化出3株具有脱硫能力的菌株。对比其脱硫效率得到一株均有较强脱硫能力的菌株AS-2，经鉴定为巴利阿里假单胞菌（Pseudomonas balearica）。

（2）通过单因素实验得出菌株AS-2的最佳脱硫条件：初始pH值为7.0，接种量为3%，温度为33℃，摇床转速为160r·min-1。在此条件下菌株AS-2对硫化物的去除率达72.13%，硫酸盐的生成率达69.74%，较未优化条件时提高11.33%。

（3）在优化的条件下，将菌株AS-2接种至含有500×10-6H2S气体的培养基中24h，对H2S的去除率可达95.66%，而无菌空白组去除率仅为11.70%，验证菌株AS-2确实具有较强的脱硫能力。