Box-Behnken响应曲面法优化药对生-炒酸枣仁中总黄酮及总皂苷的提取工艺*

王艳艳，汪郁琦，闫金铭，黄莉莉，李廷利

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子，味甘、酸，性平[1]，具有补肝，宁心，敛汗，生津等功效，用于虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴等症，主要用于治疗神经衰弱和各种失眠症[2,3]。自酸枣仁出现生、炒品，即有生熟异治之说，《本草纲目》中有“酸枣仁，睡多生使，不得睡炒熟”，“熟用疗胆虚不得眠、烦渴、虚汗之证；生品，疗胆热好眠”的记载[4]。著名老中医施今墨先生将生酸枣仁与炒酸枣仁作为药对，二者配伍使用，其认为“熟枣仁补肝宁心安神，生枣仁清肝宁心安神。二药参合，一补一清，清补合法，宁心安神的力量增强”[5-7]。本课题组前期实验研究发现，药对生-炒酸枣仁具有明显的抗抑郁作用，且优于生、炒酸枣仁单用；生、炒酸枣仁配伍后化学成分未出现显著变化，而斯皮诺素含量和酸枣仁皂苷A含量增加[8]。本实验拟通过单因素试验与响应面分析法优化药对生-炒酸枣仁中总黄酮及总皂苷的乙醇回流提取工艺，为其药理作用及临床应用研究提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器

SP-1920型比例双光束紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；EYEL4型旋转蒸发仪N-1100S（上海爱郎仪器有限公司）；光明电热恒温水温箱（北京市永光明医疗器械有限公司），BJ-800A型拜杰多功能粉碎机（拜杰仪器有限公司）；MS105型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 实验试剂

生酸枣仁药材，购于河北省保定市安国药材市场，经鉴定为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa的干燥成熟种子；炒枣仁药材，取净酸枣仁，照清炒法（通则0213）炒至鼓起，色微变深[3]；芦丁、酸枣仁皂苷B（中国食品药品检定研究院，批号：MUST-15020412，纯度：HPLC≥97.81%）；甲醇为色谱纯，香草醛、高氯酸、冰乙酸、石油醚、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、无水乙醇均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 生、炒酸枣仁药对总皂苷制备方法 取生、炒酸枣仁粉末(过40目筛)适量，精密称定，混匀（质量比1∶1），脱脂，分别加入不同体积，不同浓度的乙醇溶液，加热回流2次，滤过，滤渣用不同体积分数的乙醇洗涤，合并洗液与滤液，回收溶剂至干，70%甲醇溶解，于10mL容量瓶中定容，0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

2.1.2 标准曲线的绘制

2.1.2.1 总黄酮标准曲线 称取芦丁标准品约10mg，精密称定11.7mg于10mL容量瓶中，精密移取 0.5、1、1.5、2、2.5、3mL 于 10mL 容量瓶中，依次加入 5%NaNO20.6mL，摇匀，放置 6min，10%硝酸铝溶液 0.4mL，摇匀，放置 6min，4%NaOH溶液4.0mL，摇匀，用无水乙醇定容，摇匀，放置15min，双光束紫外可见分光光度计上于200～700nm波长范围内扫描，测得最大吸收波长为510nm。以质量浓度（C,mg·mL-1）对吸光度 A进行线性回归，回归方程A=7.1543C+0.0309，R2=0.9987。结果显示总黄酮在58.5～351μg范围内线性关系良好。

2.1.2.2 总皂苷标准曲线 称取酸枣仁皂苷B约4mg，精密称定为4.17mg于10mL的容量瓶中，用甲醇定容，摇匀；分别精密移取120、220、280、360、440、520μL于10mL具塞试管中，依次加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL，HClO40.8mL，摇匀，密封，置60℃水浴中加热15min，立即置冰水浴中冷却2min，精密加入HAc 5.0mL，摇匀。双光束紫外可见分光光度计上于200～700nm波长范围内扫描，测得最大吸收波长为480nm。以酸枣仁皂苷B质量（x，mg）对吸光度值y进行线性回归，计算得到回归方程y=3.6132x+0.0732，R2为0.9991，结果表明总皂苷在50.0～217μg质量范围内呈良好线性关系。

2.1.3 精密度实验 按照2.1.1项下制备样品溶液，按2.1.2项下显色。分别测定吸光度，连续测定6次，测得总黄酮、总皂苷的吸光度平均值为0.657、0.525，RSD为0.304%、1.59%，结果表明，所用仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性实验 分别在 0、3、6、12、24、48h 测定 总 黄 酮 的 吸 光 度 ， 在 0、10、30、60、120、150、180min测定总皂苷的吸光度，其吸光度平均值分别为 0.664、0.511，RSD 为 1.01%、1.53%，结果表明，待测样品在考察时间范围内稳定性良好。

2.1.5 重复性实验 取同一药材，制备6份样品溶液，测定总黄酮和总皂苷吸光度平均值分别为0.651、0.543，RSD 为 1.61%、1.25%。表明该法具有良好的重复性。

2.1.6 加样回收率实验 精密称取已知含量的6份样品，分别加芦丁、酸枣仁皂苷B对照品适量，按2.1.1项和2.1.2项下方法操作，平均回收率分别为97.5%、101%，RSD分别为1.43%、3.04%。

表1 总黄酮加样回收实验结果Tab.1 Results of total flavonoids recovery test

表2 总皂苷加样回收实验结果Tab.2 Total saponin sample recovery experiment results

2.1.7 药对中总黄酮及总皂苷含量测定 分别称定脱脂后的生酸枣仁、炒酸枣仁、生-炒酸枣仁约1.4g，精密称定，按2.1.1项下，在乙醇体积分数70%、液固比 20mL·g-1、提取温度 80℃，提取时间60min条件下测定总皂苷的含量，结果见表3。

表3 总黄酮及总皂苷含量测定结果Tab.3 Results of determination of total flavonoids and total saponins

2.2 单因素实验

按2.1.1项下方法，其他因素不变的情况下，分别考察乙醇体积分数、液固比、提取温度、提取时间对药对生-炒酸枣仁中总黄酮及总皂苷得率的影响，筛选出各因素的最适条件。

2.2.1 乙醇体积分数 液固比20mL·g-1、提取温度80℃、提取时间为60min时，考察乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%时药对中总黄酮及总皂苷的得率，结果见图1。

图1 乙醇体积分数对药对中总黄酮及总皂苷得率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the yield of total flavonoids and total saponins of Herb-partners

由图1可知，随着乙醇体积分数的升高，总皂苷得率增加，70%时达到最大值。同时，乙醇体积分数为70%时总黄酮得率最高，因此，确定最佳乙醇体积分数为70%。

2.2.2 液固比 乙醇体积分数70%、提取温度80℃、提取时间60min时，考察液固比分别为10、15、20、25、30mL·g-1时，药对中总黄酮及总皂苷的得率，结果见图2。

图2 液固比对药对中总黄酮及总皂苷得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids and total saponins of Herb-partners

由图2可知，与总黄酮得率比较，总皂苷得率随着液固比增加趋势显著，二者均在20mL·g-1的比率时得率达到最大值。因此，确定适宜液固比为20mL·g-1。

2.2.3 提取温度 乙醇体积分数70%、液固比20mL·g-1、提取时间60min时，考察不同提取温度（60、70、80、90、100℃）对药对中总黄酮及总皂苷得率的影响，结果见图3。

图3 提取温度对药对中总黄酮及总皂苷得率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of total flavonoids and total saponins of Herb-partners

由图3可知，温度在80℃以下，总皂苷和总黄酮得率随温度升高而增大，80℃时达到最大值，当提取温度超过80℃后二者得率均下降，从而确定适宜提取温度为80℃。

2.2.4 提取时间 乙醇体积分数70%、液固比20mL·g-1、提取温度 80℃时，考察不同提取时间（20、40、60、80、100min） 对药对中总黄酮及总皂苷得率的影响，见图4。

图4 提取时间对药对中总黄酮及总皂苷得率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids and total saponins of Herb-partners

由图4可知，总皂苷和总黄酮得率提取时间随时间的增加而增大，60min时二者得率均达到最高，故确定适宜提取时间为60min。

2.3 响应曲面试验

2.3.1 响应曲面试验设计 分别以总皂苷和总黄酮得率为考察指标，根据单因素实验结果，在各因素最大得率附近进行方差分析。乙醇体积分数、液固比、提取温度、提取时间4个因素，黄酮得率方差分别为：0.0466、0.0735、0.0345、0.0180，皂苷得率方差分别为：0.307、0.233、0.198、0.176。鉴于黄酮得率方差极小，故本实验选取皂苷得率为响应指标设计响应曲面试验，在提取工艺的4个因素中选择方差较大的3个因素进行考察，故本实验选择乙醇体积分数、液固比、提取温度3个因素进行实验设计。

应用软件 Design-Expert 8.0.6进行3因素 3水平Box-Behnken响应曲面试验设计，并进行数据分析，各因素及水平，见表4。试验设计及相应Box-Behnken Design数据见表5。

表4 响应曲面因素与水平Tab.4 Variables and levels in response surface design

表5 Box-Behnken试验设计与响应值Tab.5 Box-Behnken design and observed responses

2.3.2 回归方程与方差分析 以软件Design-Expert 8.0.6分析，总皂苷得率（Y）与乙醇体积分数（A）、液固比（B）、提取温度（C）的二元多项回归方程为Y=6.30-0.085A-0.047B+0.08 9C+0.00250AB-0.0032 50AC-0.028BC-0.38A2-0.31B2-0.27C2。

表6中 R2Adj值0.975，为失拟项系数，表明97.5%实际数据能用模型解释。R2值0.989，为相关系数，表明理论值与实测值有很高的关联性。从表6回归方程方差分析得知，模型 P值＜0.0001，提示该模型差异有统计学意义。失拟项值为0.912，差异无统计学意义（P＞0.05），表明该模型对试验中的拟合较好[10]。

表6 回归方程方差分析Tab.6 Analysis of varlance（ANOVA）of the regression model

从表 6 可见 A、C、A2、B2、C2对总皂苷得率的影响，差异均有统计学意义（P＜0.01）。B的P值为0.0309，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3.3 响应曲面图分析 根据检测结果绘制各因素的响应曲面与等高线，其中，响应曲面坡度的平缓陡峭程度反映因素间交互效应的显著性，曲面坡度陡峭，显著性越大，曲面坡度平缓，显著性越小[11]；而等高线的形状反映因素间交互效应的强弱大小，两因素交互作用强则等高线为椭圆形，圆形则相反[12]。如图5所示，乙醇体积分数与提取温度、液固比与提取温度和乙醇体积分数与液固比的响应曲面坡度较陡峭，等高线趋于椭圆形，表明上述3组因素间均具有一定的交互作用，但不显著，此结果与回归方程方差分析结果一致。

图5 乙醇体积分数、液固比和提取温度对总皂苷得率影响的响应曲面与等高线Fig.5 Response surface and contour of the effect of ethanol volume fraction,liquid-solid ratio and extraction temperature on total saponin yield

2.3.4 验证工艺 利用Design-Expert 8.0.6软件预测的酸枣仁总皂苷提取最佳工艺为：液固比20mL·g-1、乙醇体积分数70%、温度80℃、时间60min。对该方案进行验证实验，总皂苷得率为6.30%，模型理论值为6.32%，表明该模型能很好地模拟生-炒酸枣仁总皂苷的提取条件，且响应曲面优化的工艺稳定可行。

3 小结与讨论

酸枣仁主要含有脂肪油、皂苷类、黄酮类、三萜类和多糖等化学成分，具有镇静催眠、抗惊厥、抗心律失常、改善心肌缺血、增强免疫、降脂、抗缺氧、保护神经系统等药理作用[3，14]。前期实验研究发现，生、酸枣仁药对抗抑郁作用机制为抑制突触间隙5-HT的重摄取，增加突触后膜5-HT1A受体，提高中枢5-HT能系统的功能和兴奋性，抑制突触间隙DA的重摄取，提高中枢部分脑区DA含量，且药对的抗抑郁作用优于生、炒酸枣仁单用，其部分成分含量增加[8]。本实验在最佳工艺条件下，分别比较生酸枣仁、炒酸枣仁和药对生-炒酸枣仁的总黄酮及总皂苷得率的差异，结果显示，药对生-炒酸枣仁两类代表成分的含量显著升高，此结果可以为其药效学差异提供依据。

本实验为排除酸枣仁中油脂的干扰，首先利用石油醚对生，炒酸枣仁药材进行脱脂，然后在不同条件下通过乙醇回流提取，借助双波长紫外分光光度计测得总黄酮及总皂苷含量，并计算得率。分别考察了乙醇体积分数、液固比、提取时间、提取温度对得率的影响，并结合Box-Behnken响应曲面法试验设计得到最优提取工艺参数：液固比20mL·g-1、乙醇体积分数70%、提取温度80℃、提取时间60min。总皂苷得率为（6.29±0.06）%，总黄酮得率为（2.48±0.03）%。

响应曲面是一种有效的优化工艺参数的方法，可通过软件Design-Expert 8.0.6进行响应曲面试验，多因素分析、数据处理，得到回归方程且能进行因素间交互实验，分析交互作用强弱及显著性，较其他试验设计方法具有更多的优势[15，16]。经工艺验证实验证明，该提取工艺操作简单，提取总黄酮及总皂苷得率高，稳定性良好，采用此法检测药对生-炒酸枣仁的总黄酮及总皂苷含量，操作方法简单，精密度，重复性，稳定性，加样回收率均较好，该工艺的优化为其药效学及机制研究奠定基础，也为临床用药提供参考。