紫外链霉素复合诱变选育高产surfactin菌株研究

莫怡琴，刘 杰，刘 芸，胡美忠

（铜仁职业技术学院，贵州铜仁 554300）

Surfactin是芽孢杆菌属代谢产生的一种抗菌脂肽，化学结构为7个氨基酸残基寡肽与13～15个碳的β羟基脂肪酸缩合成的环状结构（田秋月等，2019）。Surfactin具有许多优良的性能，如抗菌活性，能抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等致病菌，且与抗生素具有不同的作用机制；抗病毒活性，对疱疹病毒、包膜病毒等病毒具有抑制活性 （Kracht等，1999；Kameda 等，1974）；抗肿瘤活性，能控制人类结肠癌细胞株的繁殖（Kim等，2007）。Surfactin的优良性能使其在畜牧养殖、医药、食品、化工等方面具有潜在的应用价值。

大量研究发现，surfactin在畜牧养殖业中具有替代抗生素的潜力，胡美忠等（2018）雏鸡养殖试验发现，surfactin在日增重和死亡率及血液生化指标方面优于金霉素，翟少伟等（2016）研究指出，饲料中添加surfactin可以提高中华鳖稚鳖的生长性能和肠道消化酶活性。然而自然界野生芽孢杆菌菌株产surfactin产量极低，本实验室筛选的一株产surfactin的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S21，其初始产量约为0.02～0.03 mg/mL，极低的产量制约了surfactin的进一步研究及应用，为获得高产surfactin菌株，本试验以B.subtilis S21为出发菌株，采用紫外和链霉素复合诱变选育高产surfactin菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种 试验菌株：B.subtilis，铜仁职业技术学院民族中兽药分离纯化技术国家地方联合工程研究中心中兽药微生物发酵研究室筛选鉴定，并专利保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No：15544。

1.1.2 主要试剂及设备 Surfactin标准品，sigma公司生产，纯度为98%；链霉素，华北制药生产，纯度为98%；无菌脱纤维羊血，鸿泉生物生产；其他试剂，市售，分析纯。

ZHJH-C1214C型超净工作台，上海智城；1100型液相色谱仪，安捷伦；HVE-50型高压灭菌锅，北方华粤；DELTA 320型pH计，上海闵胜；BPH-9042型恒温培养箱，上海一恒。

1.1.3 培养基与缓冲液 LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉 5 g，氯化钠 10 g，蒸馏水 1 L，pH 7.0～7.2。

pH 7.8无菌磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钾5.59 g与磷酸二氢钾0.41 g，加蒸馏水定容至1000 mL，过滤，121 ℃灭菌 20 min。

LiCl的配制：准确称取3 g LiCl固体于10 mL容量瓶中，先加入6 mL pH 7.8的磷酸缓冲液溶解后，定容至10 mL，配制成浓度30%的母液，4℃保藏，临用前用0.45μm无菌滤膜过滤。

链霉素母液的配制：准确称取0.5 g链霉素粉末置于10 mL容量瓶中，先加入6 mL pH 7.8的磷酸缓冲液溶解后，定容至10 mL，配制成50000 mg/L的溶液，再稀释至50 mg/L得母液，4℃保藏，临用前用0.45μm无菌滤膜过滤。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化 -70℃保藏的B.subtilis S21，-4℃解冻后，将B.subtilis S21转接至LB固体培养基，37℃培养24 h后，接种环挑取某一单菌落转接于LB液体培养基，37℃振荡培养12～16 h，备用。

1.2.2 紫外诱变 分别吸取活化的B.subtilis S21 2 mL，置于6个无菌培养皿，轻轻摇匀，黑暗条件下离紫外灯12 cm下分别照射0（对照组）、60、120、180、240、300 s。 照射后的菌液用无菌生理盐水进行梯度稀释至1010倍后，取100μL稀释液涂平板，编号分别为 0、1、2、3、4、5。37 ℃避光倒置培养36 h，选取致死率为80%～90%的平板单个菌落，用无菌牙签挑至LB固体培养基上。37℃避光倒置培养24 h后，菌落再转接至血琼脂平板上（灭菌后的LB固体培养基冷却到60℃左右时加入10%无菌脱纤维羊血混匀倒平板，下同），在37℃倒置培养72 h，用游标卡尺测溶血圈大小和菌体大小。

1.2.3 链霉素诱变 经紫外诱变选育，得到二株效果较佳的菌株，编号为19、27。19、27号菌株分别按1.2.1方式活化后，取1 mL菌液和1 mL 30%氯化锂在2 mL离心管中混匀（氯化锂作为协同诱变剂），在37℃下保温30 min后，吸取1 mL混合液，稀释104倍，取1 mL稀释液和1mL生理盐水加入到23 mL LB固体培养基中混匀倒平板（对照组）；另取1 mL稀释液和1 mL 50 mg/L链霉素溶液加入到23 mL LB固体培养基中混匀倒平板（链霉素浓度根据前期致死率试验确定，此浓度菌株的致死率约为80%～90%）。37℃倒置培养24 h后，挑取单个菌落转接至LB固体培养基。37℃倒置培养24 h，再转接至血琼脂平板上，37℃倒置培养72 h，用游标卡尺测溶血圈大小和菌体大小。

1.2.4 HPLC复检 Surfactin标准品浓度与峰面积关系的方程制作：精密配制surfactin（sigma）标准品梯度溶液，采用安捷伦1100型色谱仪检测其峰面积与浓度的关系，得到其标准曲线方程。液相色谱条件：色谱柱，安捷伦5 TC-C18，检测波长为210 nm，流速1 mL/min，时间0～20 min，90%乙腈-90%乙腈（有机相和水相均含0.1%三氟乙酸）。

经过紫外、链霉素诱变后，得到溶血圈大小/菌体大小比值比较大的菌12株，分别接种于50 mL LB液体培养基中，37℃、180 r/min振荡培养48 h后，将菌液在80℃烘箱中烘干，用25 mL甲醇溶解，10000 r/min离心10 min，过滤后，同标准曲线方程色谱条件，液相测定surfactin的峰面积，通过峰面积计算出surfactin含量。

1.2.5 稳定性检测 筛选出效果最好的菌株，传代8代后，通过液相检测其surfactin含量。

2 结果分析

2.1 紫外诱变 从B.subtilis S21出发，挑取了33个诱变菌落，其溶血圈直径/菌落直径见表1。

从表1可看出，对照组菌株溶血圈直径/菌落为1.09，其余突变体的溶血圈直径/菌落直径比值不一，但均比对照组高，说明选取的菌落均发生了正突变。96号处理溶血圈直径/菌落直径比值为1.3，相对于对照，增加最少，只增加19.27%，27号处理溶血圈直径/菌落比值为2.61，19号处理溶血圈直径/菌落直径为2.51，相对于对照分别增加了139.45%、130.3%。

表1 B.subtilis S21紫外线诱变后溶血圈及菌体

Surfactin会产生溶血现象，其溶血性能与其浓度呈正相关，故可根据surfactin产生溶血的原理来初步选育高产surfactin菌株，高产surfactin菌株，其溶血圈直径/菌落直径会越大（郅岩，2017；李媛，2009）。

2.2 链霉素诱变

2.2.1 氯化锂和链霉素对B.subtilis S21-19的复合诱变 从B.subtilis S21-19出发，挑取了38个诱变菌落，其溶血圈直径/菌落直径见表2。

表2 B.subtilis S21-19氯化锂和链霉素诱变处理后溶血圈及菌体

从表2可以看出，对照组菌株溶血圈直径/菌落直径为3（不同试验批次，因为平板的厚度及培养时间等有不同，其菌株溶血圈直径/菌落直径会有变化，下同），其余突变体的溶血圈直径/菌落直径比值不一，但比值均较对照组下降，只有7号处理、4号处理有提高，说明选取的菌落经过氯化锂和链霉素复合诱变后多数发生了负突变，少数发生正突变。38号处理溶血圈直径/菌落直径比值为1.44，相对于对照组，减少最为严重，减少52%，7号处理溶血圈直径/菌落比值为3.68，增加最多，为22.67%，4号处理溶血圈直径/菌落直径为3.45，增加15%。

2.2.2 氯化锂和链霉素对B.subtilis S21-27的复合诱变 从B.subtilis S21-27出发，挑取了38个诱变菌落，其溶血圈直径/菌落直径见表3。

表3 B.subtilis S21-27氯化锂和链霉素诱变溶血圈及菌体

从表3可以看出，对照菌株溶血圈直径/菌落为1.42，其余突变体的溶血圈直径/菌落直径比值不一，但比值均比对照组有提高。4`号处理溶血圈直径/菌落直径比值为 4.34，增加最多，为205.63%；1`号处理溶血圈直径/菌落直径比值为4.22次之，为197.18%。

2.2.3 HPLC复测 液相色谱获得surfactin峰面积与浓度 （mg/mL）的标准曲线为：y=6920.7x+404.36，R2=0.9976 （y为峰面积，x 为浓度）（田秋月等，2019）。

液相检测溶血圈/菌体结果较好的菌株11株，surfactin的含量结果见表4。从表可以看出，溶血圈/菌体比值与液相检测结果趋势一致，证实可以用此方法进行初筛，然后根据初筛结果，再用液相进行复测，最终得到筛选结果良好的菌株。

表4 HPLC检测筛选菌株发酵液surfactin含量

2.3 稳定性检测 选取诱变后比初始菌株产量增加 800%以上的菌株 5 株 （1`、4`、5`、38`、50`）检测发酵液中surfactin含量，发现只有38`保持稳定，传代8代，每代测其发酵液中surfactin含量为0.28～0.35 mg/mL，其第8代发酵液surfactin含量为0.28 mg/mL，比原始菌株S21增加了9.33倍。其余4株菌surfactin含量波动较大，传代至第7代后，surfactin含量在0.1 mg/mL以内。

3 结论

Surfactin是一种极为优良、可替代抗生素在畜牧业中使用的抗菌脂肽，但是极低的产量制约了surfactin的开发利用，因此提升surfactin产量是大规模开发利用surfactin的前提。诱变是提升代谢产物产量的一种常用方法，具有经济时效优点，常用来进行诱变育种，以获得高产种（龚定芳等，2019）。

本试验通过紫外和链霉素复合诱变，使其产量从最初的0.03 mg/mL提升到0.34 mg/mL（38'菌株），且经过8代传代培养后，其产量还稳定在0.28 mg/mL，证明38'菌株遗传稳定性较佳，下一步可采用此菌株进行培养基优化，进一步提升surfactin产量。