大理弥渡热泉耐热脂肪酶产生菌的筛选及其酶活性研究

桑 鹏 ，刘林波 ， 陈贵元 ，杨力权 *

（1.大理大学农学与生物科学学院，云南大理671003；2.大理大学基础医学院，云南大理671000；3.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理671000）

脂肪酶全称为酰基甘油水解酶，广泛分布于动物、植物和微生物体内，其中以微生物类脂肪酶居多。研究发现，产脂肪酶的微生物有：荧光假单胞菌、黑曲霉菌、根霉菌、毛霉圆柱假丝酵母菌、圆弧青霉粘质色杆菌和枯草杆菌（陈雄金等，2008）。脂肪酶可以催化脂水解、酯交换、酯合成等反应，因而在食品、化妆品、皮革、生物柴油等领域均具有广泛的应用。

耐热脂肪酶和普通脂肪酶相比具有耐高温的特点。耐热脂肪酶主要分离自一些特殊环境中的微生物，例如热泉、深海热液、废水处理厂等特殊环境微生物。在商业上也因其在高温下具有较高的反应效率，可以减少微生物污染的可能性，降低反应溶液的黏度，提高底物的溶解度等特点，而受到越来越多的重视，并且已经有很多耐热脂肪酶被纯化、克隆和进行酶学性质的研究，被广泛应用于洗涤剂和生活污水等方面（刘秀萌等，2016）。因此，筛选产高温脂肪酶的菌株成为了一项重要的工作。本试验以大理弥渡热泉底泥为材料，筛选出能产耐高温脂肪酶的菌株，并对其分类鉴定及酶学性质研究，为脂肪酶的发酵工业新备选菌株的开发应用提供资源，为进一步开发利用该菌株提供基础，也为进一步获得产脂肪酶基因的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤样品 土壤样品来自大理弥渡县石夹泉热泉的底泥，热泉水温43℃。

1.1.2 主要仪器 显微镜（奥林巴斯），紫外可见光分光光度计（上海菁华仪器公司），高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器公司），恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），水浴恒温摇床（常州国华电器有限公司），高压蒸汽灭菌锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司），超净工作台（苏州净化设备有限公司），PCR扩增仪（美国ABI），电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.3 试剂 酵母抽提物、蛋白胨为英国进口；琼脂粉为西班牙进口分装；三丁酸甘油酯、氯化钠、结晶紫、碘、乙醇、孔雀绿、番红均为国产分析纯试剂；DNA抽提试剂盒、PCR扩增试剂盒、胶回收试剂盒和DNA分子量标准品均购自北京天根生物技术有限公司。

1.1.4 培养基 富集培养基：蛋白胨5 g/L，酵母粉1 g/L；自然pH。

筛选培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，三丁酸甘油酯2 ml/L，琼脂粉20 g/L；自然pH。

LB液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0。

基本发酵培养基：葡萄糖2.5 g，蛋白胨10 g，K2HPO40.5 g，硫酸铵 0.5 g，硫酸镁 0.25 g，橄榄油5 mL，加蒸馏水定容至500 mL，自然pH。上述培养基均在121℃，0.1 MPa下灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株富集 称取石夹泉热泉底泥2 g于45 mL的无菌蒸馏水中，150 r/min，振荡15 min。在无菌条件下，用移液枪吸取5 mL悬液于50 mL的富集培养基中，将接种好的富集培养基置于43℃，转速为150 r/min的水浴恒温振荡培养箱中振荡培养24 h。

1.2.2 菌株初筛 将富集好的菌液稀释至10-3、10-6、10-9倍，用移液枪分别吸取稀释的菌液150μL接种在筛选培养基平板上，涂布均匀。于37℃，倒置培养24 h。菌落周围如果有透明圈出现，说明该菌株能产生脂肪酶。

1.2.3 菌株复筛 将初筛得到的菌株取少量接种于种子瓶 （LB液体培养基），43℃培养24 h后，将种子液按2%的接种量接入到发酵培养基，43℃，150 r/min水浴摇床培养一周。离心取上清测酶活性。

酶活性测定：参照江慧芳等（2007）的方法进行。配制对硝基苯棕榈酸酯（p-NPP）底物溶液10 mmol/L和对硝基苯酚（p-NP）标准溶液1 mmol/L：将p-NP标准溶液用1 mol/L的碳酸钠溶液稀释成 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μmol/L 10个梯度，分别取1 mL，再分别加入0.5 mol/L的三氯乙酸1 mL和0.5 mol/L的NaOH 3 mL，混匀后410 nm处测定吸光度，绘制对硝基苯酚标准曲线。

取20μL p-NPP底物溶液，加入780μL Tris-HCl缓冲液，37℃预热5 min后加入200μL酶液，反应10 min后加入0.5 mol/L的三氯乙酸1 mL，混匀后放置5 min终止反应，再加入0.5 mol/L的NaOH 3 mL调pH，（将200μL蒸馏水替换200μL酶液，其他条件不变，即得空白），于410 nm处测定吸光度。对照标准曲线算出生成的p-NP浓度，进而计算出酶活力。

酶活力单位定义为：在一定条件下，每分钟释放出1μmoL对硝基苯酚的酶量定义为1个酶活力单位（U）。

计算公式：X=c V/t V'；

式中：X为脂肪酶活力，U/mL；c为对硝基苯酚浓度，μmol/L；V为酸碱调节后的反应液终体积，mL；V'为酶液的用量，mL；t为作用时间，min。1.2.4 菌株鉴定

1.2.4.1 形态学、生理生化特征 产酶菌株的形态观察及生理生化试验参照黄秀梨等（2008）的方法进行。

1.2.4.2 16SrRNA基因序列测序和分析 根据北京天根生化科技有限公司提供的试剂盒以及说明书进行DNA的提取。使用通用引物 27F:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， 和 1492R:5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，扩增细菌 16SrDNA。扩增条件为：预变性94℃，5 min；变性94℃，30 s；退火 50 ℃，45 s；延伸 72 ℃，100 s，最后延伸72℃，5 min，循环30次，将PCR产物加入预先制备好的0.8%的琼脂糖凝胶中，140 V，电泳1 h，琼脂糖凝胶回收根据北天根生化科技有限公司提供的试剂盒以及说明书进行PCR产物回收。将PCR回收产物送广州英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，将获得的序列提交GenBank （http://www.ncbi.nlm.nih.gov），根据BLAST数据库中细菌16SrRNA基因序列进行相似性比较分析，利用MEGA 5.0软件进行系统进化分析。

1.2.5 菌株最适生长温度 按接种量为1%的菌接种于LB液体培养基中，置于不同的温度（25、31、37、43、49、55 ℃）下摇床培养 24 h，然后在波长600 nm处测定各个温度下菌株生长的吸光值，以确定菌株的最适生长温度。

1.2.6 酶学性质

1.2.6.1 温度对酶活力的影响 将酶液分别在4～75℃条件下测定脂肪酶的活力。

1.2.6.2 pH对酶活力的影响 在最适酶活力温度下，配制不同pH的反应缓冲液，检测不同的pH对脂肪酶活力的影响。

1.2.6.3 酶的热稳定性 将1 mL酶液分别置于不同的温度（4、25、37、55、75 ℃）下保温，保温一定时间后测定酶活力，以保温0 min温度下所测得的酶活力为对照组，其余温度下所测得的酶活力与其相比并计算相对酶活力，用相对酶活力绘制出酶的热稳定性曲线。

1.2.6.4 金属离子对酶活力的影响 将1 mL的酶液和10μL浓度为0.1 mol/L的金属离子（Ca2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、K+）混匀，将其放置到4℃冰箱过夜，第二天测定各组酶活力。以未加入金属离子的酶液反应体系作为对照组，测定和观察金属离子对酶活力的影响。

2 结果与分析

2.1 产酶菌株的筛选 根据水解圈直径与菌落直径比值的大小，筛选出3株产高温脂肪酶菌株，其中1号菌株水解圈直径与菌落直径比值（R1/R2）最大。经复筛发现3株菌均为分泌型脂肪酶产生菌，且1号菌株酶活最高，达到106.5 U/mL，与初筛的结果相符。因此，选择1号菌株作为后续试验研究菌株，命名为Lip-43。

2.2 菌种鉴定

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验，计量资料以表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.2.1 形态学、生理生化特征 Lip-43在LB培养基上37℃培养72 h后，菌落呈乳白色，不透明，圆形隆起，黏稠，不易挑取。革兰氏染色为阴性，菌体呈球杆状，无芽孢。

对Lip-43的生理生化特性进行研究，发现V-P试验、甲基红试验结果均为弱阳性；吲哚试验、明胶试验结果均为阴性；乳糖发酵试验结果为阴性；葡萄糖发酵试验、蔗糖发酵试验结果均为能利用糖，但不产气。

2.2.2 16SrRNA基因序列及系统发育分析 16S rRNA基因测序，所获得的序列长度为1440 bp，将Lip-43的16SrRNA基因序列与GenBank数据库中的序列进行相似性比对，发现Lip-43与不动杆菌属的16SrRNA基因序列自然聚类，Lip-43的16SrRNA基因序列与13条相似性较高的序列构建系统发育树（图3），从图中可以看出Lip-43与Acinetobacter sp.Acinetobacterbaumannii的菌株聚为一群，相似性也最高，表明Lip-43与Acinetobacter sp.的亲缘关系最近。

根据Lip-43的形态及生理生化特征，结合《伯杰氏细菌鉴定手册》（第八版）（布坎南等，1984），以及Lip-43 16SrRNA基因序列及系统发育树，将Lip-43初步鉴定为不动杆菌属（Acinetobacter sp.）的一株菌，命名为Acinetobacter sp.Lip-43。

2.3 菌种的最适生长温度 按照试验方法，在波长600 nm处测定不同温度培养下LB培养基的吸光值，以600 nm处的吸光值为纵坐标，温度为横坐标作温度—吸光值关系曲线，结果如图4。

从图4中可知，温度为25～37℃时，菌体的生长量随着温度的升高而增加，37℃时，LB培养基在600 nm下的吸光值最高，表明37℃是菌株的最适生长温度。37℃以后，菌体生长量随着温度的升高而下降，菌株在55℃下菌体还有一定生长，菌株属于典型的耐高温菌。

2.4 菌株Lip-43的脂肪酶性质

2.4.1 对硝基苯酚标准曲线 根据制作对硝基苯酚标准曲线的方法，制作出的对硝基苯酚标准曲线线性回归方程为Y=0.0036X+0.0006，线性相关系数R2=0.9905，表明线性比较好。

2.4.2 温度对酶活的影响 按照试验方法，在不同温度下测定酶的活性，以酶活力为纵坐标，温度为横坐标作温度—酶活关系曲线（图5）。

从图5可以看出，低温能抑制酶的活性，但不能使酶失活，在4℃的条件下，脂肪酶仍具有活性，但活性较低，4～75℃，随着温度升高，酶活力增加，在45℃时，酶活力达到最大值，为106.5 U/mL，在45℃之后，随着温度升高，脂肪酶活力反而降低，部分酶失去活性。酶反应都有一个最适反应温度，在没有达到最适反应温度之前，酶活力随着温度升高而增加，超过最适反应温度，酶开始失活，反应速度降低，45℃是脂肪酶的最适反应温度，菌株产生的脂肪酶属于典型的耐热脂肪酶。

2.4.3 脂肪酶的最适反应pH 从图6可以看出，pH 5.0之前，脂肪酶活力随着pH的升高而升高，在pH 5.0之后，脂肪酶活力下降且下降速度较快，酶促反应都有最适pH，当反应体系pH大于或者小于酶促反应的最适pH时，酶活力相对于最适酶促反应pH条件下的酶活力较低。因此，pH 5.0是该脂肪酶的最适反应pH，表明菌株Lip-43产生的脂肪酶属于酸性脂肪酶。

2.4.4 脂肪酶热稳定性 测定各个温度下不同时间点脂肪酶的酶活，以保温0 min温度下所测得的酶活为对照组，其余温度下所测得的酶活与其相比并计算相对酶活，用相对酶活绘制出酶的热稳定性曲线，结果如图7所示。

由图7可以看出，Lip-43脂肪酶在37℃以下能够在长时间内保持相对稳定的酶活，表明该酶可在较低的温度下保存，酶在75℃保温120 min，相对酶活损失近50%，菌株产生的酶虽然是高温脂肪酶，但酶在较高的温度下，酶活性随着保温的时间增加而降低，酶的热稳定性较差，温度耐受性质符合一般酶的性质。

2.4.5 金属离子对酶活的影响 本试验中将加有金属离子的稀释酶液在4℃中保温过夜，以未加入金属离子的酶液反应体系作为对照组，测定各种金属离子对酶活力的影响，结果见图8。

从图8可知，Zn2+和Ca2+对脂肪酶的活力有一定的抑制作用，其余离子均有一定的促进作用，其中Mn2+对脂肪酶活力的促进作用最为明显，金属离子可通过与酶的活性中心结合，影响酶活性。因此，Zn2+和Ca2+与酶的活性基团结合，抑制酶的活性中心与底物结合，使酶活性降低。其余金属离子与酶活性中心结合后，改变了酶活性基团的构象，使底物与活性中心结合能力更强，酶活力增加。

3 结论

本试验从大理弥渡白总旗热泉筛选到一株能向胞外分泌高温脂肪酶的菌株，经初步鉴定为不动杆菌，命名为Acinetobacter sp.Lip-43。菌株最适生长温度为37℃，菌株在55℃仍能生长。酶学性质研究表明：最适反应温度为45℃，最适反应pH为5.0，为酸性脂肪酶。该酶在4、25、37℃下能在较长时间内保持稳定，Zn2+和Ca2+对Lip-43脂肪酶的活力有一定的抑制作用，Mn2+、K+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均对Lip-43脂肪酶活力具有一定的促进作用，其中Mn2+的促进效果最为明显。