一例鸡大肠杆菌病的病原分离鉴定

李乔斌，谢晓东，陈 静，尹德晶，杨 鹏，程振涛，2∗，岳 筠

(1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2.贵州省动物疫病研究室，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 550008)

大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌(Escherichia coli)引起的多种动物疫病的总称，不同品种及日龄的鸡均可感染，尤其2 ～3 周龄雏鸡发病较严重，临床表现精神沉郁、腹泻、关节肿胀、气囊炎等症状，感染率、死亡率均较高[1，2]。 本试验通过细菌分离培养、生化试验、分子生物学鉴定，对贵州省安顺市某养鸡场发生疑似大肠杆菌感染病例进行诊断，通过药物敏感试验分析分离细菌的耐药特性，为本病的诊断和临床防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源贵州省安顺市某养鸡场的4 只病死鸡。

1.2 主要试剂鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、革兰氏染液，均购自北京索莱宝科技有限公司；2×TaqPCR MasterMix、DL 2 000 DNA Marker，均购自天根生化科技(北京)有限公司；Gel Extration Kit胶回收试剂盒，购自Omega 公司；微量生化鉴定管、药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 细菌分离培养无菌取病死鸡的肝脏、脾脏，划线接种于鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基，37 ℃培养24 h，对分离细菌进行纯培养。

1.4 形态学观察观察培养基上的菌落形态；纯化细菌革兰氏染色，镜检观察菌体形态。

1.5 生化实验将纯化培养的分离菌接种到17 种微量生化鉴定管中，37 ℃培养24 h，观察结果。

1.6 分子生物学鉴定

1.6.1 16S rDNA PCR 扩增采用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取分离菌DNA 为模板，用细菌16S rDNA 的通用引物(F：5’-AGAGTTTGATCCTG GCTCAC-3’；R：5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行 PCR 扩增。 PCR 扩增体系 25 μL： 模板2 μL，上、下游引物各 1 μL，PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。 扩增程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，55 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 90 s，30 个循环；72 ℃终延伸 10 min。 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。 胶回收目的基因由华大基因有限公司测序。

1.6.2 基因序列分析将分离菌的16S rDNA 基因测序结果与GenBank 中的大肠杆菌菌株进行同源性比对，确定分离菌株的种属。

1.7 药敏实验采用纸片法进行10 种药物的敏感性试验：将纯化细菌接种于普通营养琼脂培养基，分别贴上各药物纸片，37 ℃恒温培养24 h 后，测量并记录抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 菌落及细菌形态特征在鲜血琼脂培养基上生长出圆滑、凸起、半透明的灰白色菌落(见图1A)；在麦康凯培养基上生长出红色菌落(图1B)；分离菌革兰氏染色，显微镜下观察呈红色、短小杆状、两端钝圆、着色较深的革兰氏阴性杆菌(见图1C)。

2.2 生化特性分离菌能发酵乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、甘露糖；赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、苯丙氨酸脱氨酶均为阴性；吲哚、甲基红试验均为阳性，V-P、枸橼酸盐试验均为阴性；不产生硫化氢，不分解尿素，不利用丙肌醇。生化鉴定结果与大肠杆菌的生化特性相符。

2.3 分子生物学鉴定结果

2.3.1 16S rDNA PCR 扩增由图2 可见，扩增获得1 408 bp 基因片段，与预期大小一致。

2.3.2 基因序列分析由图3 可见，分离菌(Escherichia coliGZ1)16S rDNA 基因测序片段与GenBank中已知的15 株大肠杆菌菌株同源性均在99%以上，因此确定分离菌为大肠杆菌，命名为：EscGZ 2019-05。

2.4 药物敏感性分离细菌对安普霉素、泰妙菌素、多西环素等药物较敏感；对替米考星、泰万菌素、磺胺间甲氧嘧啶、泰乐菌素、阿莫西林不敏感。 见表1。

表1 分离细菌药敏试验结果

3 讨论

3.1 鸡大肠杆菌病是1 种比较常见的多发病，对养鸡业危害较大[3]。 本病因饲养管理水平、环境卫生、防治措施、有无继发其他疫病等因素的影响，发病率和死亡率有较大差异[4]。 许多集约化养鸡场由于只重视重大病毒性疫病的免疫和防控，大肠杆菌病的发病率有明显的上升趋势，已成为危害鸡群的主要细菌性疾病之一，应引起足够重视[5]。 本次病例也证实鸡大肠杆菌病在贵州省养鸡场中存在。

3.2 对细菌病的实验室诊断一般通过细菌的分离培养、形态学观察和生化试验等作出细菌种类的分析[6～9]。 在宏观上具有快速鉴别诊断的优势，但不能区分细菌的不同种属。 本试验在传统细菌分离鉴定的基础上，通过对菌株16S rDNA 的基因扩增和克隆测序，对病原的确定更加准确。

3.3 由于抗生素的广泛使用，许多细菌产生耐药性，因此对致病菌的耐药性进行确定尤为重要[10]。本次分离的大肠杆菌对替米考星、泰万菌素、磺胺间甲氧嘧啶、泰乐菌素、阿莫西林具有耐药性，与尹姣姣等[11]分离的菌株药敏实验结果相比，均对阿莫西林具有耐药性，而对其他药物的耐药性各不相同，说明各地区的分离菌株耐药性具有较为明显的差别，且耐药情况均较普遍。 选择药物时应根据药敏试验结果筛选最敏感的药物和最合适的剂量，切忌滥用、乱用，否则耐药情况很可能进一步加重[12]。