青蒿组方对球虫感染雏鸡血液中CD4+和CD8+T淋巴细胞的影响试验

郭全海，刘诗柱，王 留，刘中原，王中华

(1.商丘职业技术学院，河南 商丘 476000； 2.商丘市农村农业局，河南 商丘 476000)

球虫病是养鸡生产中的常见病，对鸡危害严重(尤其是雏鸡)。 目前我国发现有9 种鸡球虫，其中毒力最强的柔嫩艾美耳球虫寄生于鸡肠上皮细胞，鸡发病后轻则生长受阻，增加沙门氏菌等病原的感染概率，重则大量死亡，2 ～7 周龄的雏鸡病死率可高达80%，给养鸡业造成严重经济损失[1，2]。

目前预防鸡球虫病尚无高效的疫苗，主要以化学药物控制。 临床上虽然可选择的药物较多，但由于频繁用药且药量不断加大，不仅对鸡肉食品安全影响较大，而且还易产生耐药性，所以研究毒副作用小、不易产生耐药性的中药进行防治具有广阔的前景和巨大的市场[3，4]。 现在大多数抗球虫中药的研究还停留在试验阶段，而中药抗球虫的作用机理成为近年研究的热门[5]。 许多研究发现，青蒿及其衍生物对球虫有很好的抑制作用，但对鸡免疫细胞的影响研究甚少[6～9]。 本试验通过测定球虫感染鸡血液中CD4+、CD8+T 淋巴细胞的数量变化，研究青蒿组方中药对动物机体免疫力的影响，为开发具有良好抗球虫效果的中药提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物从河南正大某种鸡场购买1 日龄三黄鸡150 只，分笼饲喂于经严格消毒的笼舍中，饲喂自配无添加任何抗球虫药的饲料，饮水经煮沸消毒，自由采食、饮水，饲养至14 日龄。 试验前3 天，连续检查粪便无球虫卵囊者用于试验。

1.2 球虫卵囊鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella) 卵囊由商丘市农业农村局提供，试验前人工感染无球虫鸡继代1 次，获得试验用卵囊，29 ℃孢子化，4 ℃保存备用。

1.3 试验药物青蒿组方由青蒿、常山、地榆、黄柏、茵陈、苦参6 味中药组成，各药物购自安徽亳州中药材市场，经400 目超微粉碎机粉碎备用。

1.4 主要试剂及仪器(1)单克隆抗体(McAb)：FITC 标记鼠 IgG2b 抗鸡 CD4 单抗、FITC 标记鼠IgG1 抗鸡CD8 单抗，购自北京百奥莱博科技有限公司。 (2)鸡外周血淋巴细胞分离液试剂盒：购自索莱宝科技有限公司。 (3)流式细胞仪：商丘市人民医院。

1.5 试验分组及处理选择14 日龄、体重相近、无球虫感染的鸡120 只，随机分为4 组，每组30 只。1 组：感染给药组；2 组：感染不给药组；3 组：不感染给药组；4 组：不感染不给药组(对照组)。 给药组饲料中按质量比例添加1.5%青蒿组方微粉，饲喂至实验结束。 2 组和4 组饲喂不添加任何抗球虫药的饲料。 16 日龄时，各感染组人工经口接种鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊5×104个/只。

1.6 血样采集分别在接种球虫后第4、7、10 d，从各组随机抽取5 只鸡心脏采血，送商丘市人民医院用流式细胞仪测定CD4+、CD8+T 淋巴细胞的数值，结果用spss 软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 青蒿组方中药对试验鸡CD4+T 淋巴细胞的影响雏鸡接种球虫后第 4、7、10 d，1 组(感染给药组)的 CD4+T 淋巴细胞值分别为6.51%、4.76%、9.89%，均高于2 组(感染不给药组)，其中接种后第4、7 d 差异不显著(P＞0.05)，接种后第 10 d 差异显著(P＜0.05)。 在整个试验期，3 组(不感染给药组)CD4+T 淋巴细胞值均高于4 组(不感染不给药对照组)，并且随着饲喂天数的增加差值增大，但差异不显著(P＞0.05)。 见表1。

表1 各组CD4+T 淋巴细胞检测值 %

2.2 青蒿组方中药对试验鸡CD8+ T 淋巴细胞的影响雏鸡在接种球虫后第4、10 d，1 组的 CD8+T 淋巴细胞值均高于其他组，但差异不显著(P＜0.05)；接种球虫后的第7 d，CD8+T 淋巴细胞数量有所下降，略低于 2 组，差异不显著(P＜0.05)。 在整个试验期，3 组的CD8+T 淋巴细胞值均高于4 组，但差异不显著(P＜0.05)。 见表2。

表2 各组CD8+T 淋巴细胞检测值 %

2.3 青蒿组方中药对CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值的影响4 组CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值平均高于感染球虫的 1、2 组，1 组 CD4+T/CD8+T 淋巴细胞比值高于 2 组，但差异不显著(P＞0.05)。 其中 1、3、4组平均CD4+T/CD8+T 淋巴细胞比值均＞1，分别为1.12、1.33、1.24，而 2 组比值仅为 0.92。 见表3。

表3 各组CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值

2.4 CD4+、CD8+T 淋巴细胞变化情况随着试验时间的延长，各组CD4+、CD8+T 淋巴细胞值呈有规律的动态变化。 给药组均在7 ～10 d 后呈现上升趋势，不给药组全程均为下降趋势。 见图1、图2。

3 讨论

动物免疫学理论研究表明，机体免疫系统自身具有周密健全的调节机制，具体的效应表现在维持内环境平衡，而T 淋巴细胞和B 淋巴细胞在调控中起重要作用。 T 淋巴细胞在机体免疫中，一定条件下是相对稳定的，属于效应细胞、调节细胞，它的变化预示机体免疫功能的改变[10]。 依据T 淋巴细胞表面抗原将其分为两大类： CD4+T 淋巴细胞(辅助性T 细胞)和CD8+T 淋巴细胞(细胞毒性T 细胞)。

3.1 青蒿组方对CD4+T 淋巴细胞的影响本试验结果表明，感染给药组CD4+T 淋巴细胞值在接种球虫后第4、7、10 d 均高于感染不给组药组的试验鸡，特别在接种球虫后第10 d 显著高于后者。 同时还发现在2 个不接种球虫组中，在饲料中加入青蒿组方的CD4+T 淋巴细胞值在第4、7、10 d 也高于感染不给药组，但差异并不显著。 这一试验结果表明，接种球虫后鸡体可能受到球虫抗原的刺激，CD4+T 淋巴细胞启动了细胞免疫应答，增强了机体的免疫效应，而CD4+T 淋巴细胞值增多标志着机体免疫功能的增强。 感染给药组CD4+T 淋巴细胞数量增多说明青蒿组方中药有促进CD4+T 淋巴细胞生成的作用，进而增强了机体的免疫功能。

3.2 青蒿组方药对CD8+T 淋巴细胞的影响已有试验研究证实CD8+T 淋巴细胞的细胞毒性作用在抗球虫免疫中发挥着巨大的作用[11]。 CD8+T 淋巴细胞与被虫体感染上皮细胞直接接触，使其成为细胞毒性T 细胞的靶细胞。 CD8+T 淋巴细胞可分泌穿孔素或其他可扰乱细胞膜完整性的蛋白，破坏感染的上皮细胞或可诱导感染上皮细胞发生凋亡。 被激活的CD8+T 淋巴细胞也可释放细胞免疫因子，在球虫保护性免疫中发挥作用[12]。 本试验表明，感染给药组CD8+T 淋巴细胞值在接种球虫后第4、7、10 d 均高于感染不给药组，说明青蒿组方药能够促进CD8+T 淋巴细胞的生成，并诱导破坏上皮细胞，进而加速球虫的排出。

3.3 青蒿组方药对CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值的影响CD4+/CD8+T 淋巴细胞的比值可反映机体的免疫状态，通常比值在1～2 之间，其中1 种细胞的增多或减少均可影响另1 种细胞的存在，造成免疫的不均衡。 本试验发现，不感染球虫组CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值平均高于感染球虫组，而感染球虫给药组CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值高于感染球虫不给药组，但差异不显著。 感染球虫组的CD4+/CD8+T 淋巴细胞的平均比值均低于不感染球虫组，表明攻虫后机体的免疫水平有所下降。 感染不给药组在感染球虫后第4、7、10 d CD4+/CD8+T 淋巴细胞平均比值低于1(0.92)，说明接种球虫后机体的免疫水平是处于下降的趋势。 而感染给药组CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值在接种后的第7、10 d 均高于感染不给药组，该组CD4+/CD8+T 淋巴细胞比值仅在感染后第7 d 低于1(0.90)，到第10 d 上升至1.35，说明感染球虫后青蒿组方药具有增强机体免疫水平的功能。

4 结论

青蒿组方中药可促进鸡血液中CD4+、CD8+T 淋巴细胞生成，进而增强机体的免疫功能。