鲤鱼肠道中4种细菌的分离与生化鉴定

刘枝华，况文明，王 伦，高富铭，陈 松，董然然

(贵州大学特种水产研究所，贵州 贵阳 550025)

水产品是人们的常用食物，近年来食物中毒的案例时有发生，其中病原微生物(如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌)引起的食物中毒在全球都占有很高的比例[1～3]。 因此，绿色、生态、健康的养殖模式成为现代化水产养殖发展的需求。 在健康养殖模式下，许多药物的使用受到限制，开发以益生菌为原料制成的饲料添加剂及水质改良剂对水体及水产品进行调控成为主流，以达到无公害养殖的效果[4]。 越来越多的学者认为最好的有益菌是来自于鱼类自身的胃肠道，其中乳酸菌和枯草芽孢杆菌是使用最多的2 种益生菌。 乳酸菌可以通过产生细菌素、乳酸、过氧化氢等抑菌物质或者通过竞争营养、生存空间来抑制腐败菌和致病微生物，具有良好的抗菌活性和安全性[5，6]。 粪肠球菌(Enterococcus faecalis)又称粪链球菌，为兼性厌氧型革兰氏阳性乳酸菌，是动物肠道、口腔和生殖道的正常菌群[7]。 枯草芽孢杆菌具有耐高温、耐胆盐、耐酸性等特性，在极端环境下会产生内源性芽孢，可在饲料制粒之后保持极高的存活率[8]。 鲤鱼是我国重要的淡水养殖品种，对其研究的方向大都集中在营养需求、免疫和疾病方面[9～12]，为了解鲤鱼肠道菌群组成情况，本研究对健康鲤鱼的肠道细菌进行分离培养并进行鉴定，旨在为其饲料添加剂和水质改良剂的研发提供基础性资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康鲤鱼5 尾，购自贵阳市花溪区老朝阳村惠民生鲜超市。

1.2 主要试剂革兰氏染色剂、3%过氧化氢、培养基(MRS、普通、鲜血、肉汤、B-P、SS)等。 其中：B-P琼脂培养基购于南通凯恒生物技术发展有限公司；葡萄球菌属生化鉴定管、沙门氏菌生化鉴定管购于杭州微生物试剂有限公司；乳酸菌生化鉴定管购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；枯草芽孢杆菌生化鉴定管购于唐山拓普生物科技有限公司。 其他试剂见表1。

表1 主要试剂及来源

1.3 方法

1.3.1 肠道细菌分离培养参照胡秀彩等[13]方法进行：无菌操作收集鲤鱼肠道内容物，吸取适量富集培养液涂布于普通琼脂培养基，经29 ℃培养过夜，挑取典型菌落划线接种分离单菌落，经传代2～3 次纯化后，转种于普通琼脂斜面培养基保存备用。

1.3.2 形态观察及培养特性将菌落分别转接到相应培养基(MRS、普通、鲜血营养琼脂、肉汤、B-P)观察菌落的表观特征。 通过革兰氏染色、schaefferfulton 染色，显微镜下观察细菌形态及特征，拍照记录。 参照《伯杰氏细菌鉴定手册》[14]对细菌的形态特征进行鉴定，并将分离得到的菌株编号。

1.3.3 生化鉴定按照生化鉴定管使用说明，将纯化细菌分别接种到各生化鉴定管，进行相关项目试验，根据结果对细菌进行分类鉴定。

2 结果

2.1 菌落形态特征共从5 尾鲤鱼肠道中分离出4 株细菌，分别记为 K1、K2、K3、K4。 (1)K1 菌落在普通培养基上形态为突出的白色圆形，最明显的特征是在常温下培养一段时间后(24 ～48 h)，其颜色会逐渐变成金黄色。 在B-P 琼脂培养基上为单个的圆形菌落或多个相连的串状菌落，颜色为黑色或灰色并有明显光泽，呈凸起状，用接种环刮取时似油稠状物。 在鲜血营养琼脂培养基上有溶血现象。 普通营养肉汤为均匀的淡白带黄混浊物，用力摇动容易分散。 (2)K2 菌落在普通培养基上形态呈圆形或近似圆形，表面平滑且光亮，无色透明，菌落外沿平滑。 在 SS 琼脂培养基上(18 ～24 h)，呈无色、轻微透明、表面平滑、边缘平整菌落。 三糖铁(TSI)琼脂斜面穿刺培养后，其菌落为无色但中心稍发黑，斜面表面有一定的气泡产生且斜面变红，斜面底部为黄色且伴有黑色沉淀物质。 (3)K3 菌落均突出培养基表面0.2 ～0.3 mm，直径1.1 mm，圆形，表面润滑，边缘平整，不透光的乳白色。 (4)K4 菌落形态呈微隆起，白色，干燥且表面具有褶皱，边缘不规则。

2.2 细菌染色形态特征经染色后镜检，K1 形态呈单个或串状、革兰氏阳性菌(见图1)。 K3 为革兰氏阳性菌(见图2)，在有氧和无氧条件下均能生长，为兼性厌氧球菌且菌落及细胞形态特征与乳酸菌相似，因此可能为乳酸菌中的1 种。 K4 菌体呈椭圆或柱状，多以单个菌体存在，呈链状较少，为革兰氏阳性菌(见图3)；采用schaeffer-fulton 染色法对K4 进行染色镜检，菌体呈红色，芽孢比菌体小，被5%孔雀绿溶液染成绿色(见图4)，其形态特征与枯草芽孢杆菌相似。 4 株菌中只有K2 为革兰氏阴性菌(见图5)。

2.3 生化试验结果

2.3.1 K1 菌生化试验结果见表2。 结合其生化特性和形态特征，鉴定为金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)。

2.3.2 K2 菌生化试验结果见表3。 结合其形态特征与生化特性，鉴定为沙门氏菌(salmonella)。

表2 K1 菌生化试验结果

表3 K2 菌生化试验结果

2.3.3 K3 菌生化试验结果见表4。 经查阅《乳酸菌-生物学基础及应用》[15]，K3 菌的生化特性与肠球菌属的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)和柠檬色明串珠菌(Leuconostoc citreum)相同，且K3 菌的形态特征与粪肠球菌、柠檬色明串珠菌相同，均为革兰氏阳性、兼性厌氧的球菌，菌落形态特征均为灰白色、光滑的圆形，但柠檬色明串球菌菌落大小通常小于1 mm，粪肠球菌种的菌落大小在1 ～2 mm 之间，K3 菌落大小为1.1 mm，因此鉴定 K3为粪肠球菌。

表4 K3 菌生化试验结果

2.3.4 K4 生化试验结果见表5。 结合其菌落形态特征及生化特性确定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

表5 K4 菌生化试验结果

3 结论与讨论

3.1 金黄色葡萄球菌和沙门氏菌是引起水产动物食品安全问题的主要病菌，全球性的水产品交易大大增加了这2 种致病菌的传播。 本试验从鲤鱼肠道中分离出金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，若烹饪处理操作不当可引起食物中毒。

3.2 枯草芽孢杆菌和乳酸菌是重要的有益微生物资源，其中的某些菌株已开发利用作为饲料添加剂和微生态制剂，能抵抗肠道病原菌，降低患病率。 潘康成等[16]研究得出，在水体中泼洒枯草芽孢杆菌能明显提高虾苗的成活率。 相关研究表明添加枯草芽孢杆菌的活菌饲料对金鲫幼鱼的生长有促进作用[4]。 枯草芽孢杆菌还能抑制多种潜在致病菌，对胃和肠道环境有较强耐受能力，可以作为益生菌推广应用[17～19]。 粪肠球菌是乳酸菌中的1 种，能抑制水产品中的希瓦氏菌和假单胞菌，能有效地杀灭杀鲑气单胞菌[20]，并且还能降低水体中氨氮的含量[21]。 粪肠球菌和枯草芽孢杆菌对保护水生动物健康有很好的作用。

3.3 本试验在鲤鱼肠道中分离到沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的同时分离到粪肠球菌和枯草芽孢杆菌，且鲤鱼能健康存活，是否说明枯草芽孢杆菌和粪肠球菌对沙门氏菌和金色葡萄球菌有抑制作用还需进一步实验验证。

3.4 本次试验以传统常规方法进行细菌分离鉴定，实验过程非常繁杂，且耗时长，如果采用形态学和分子生物学方法进行鉴定会更加方便快捷。