Y2O3:Yb,Er纳米粒子的制备及生物学表征

汪沁，齐嘉欣，温金熙，周兴平

（东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620）

近年来，上转换荧光材料由于具有新颖的光学和化学性质，其合成研究引起了广泛的关注[1-2]。氧化钇（Y2O3）是一种很有前途的上转换材基质，其在掺入Yb3+和Er3+离子后，可以表现出很强的荧光性质。制备这种材料的方法多种多样，包括溶胶-凝胶法[3]、固相法[4]、共沉淀法[5]、水热法[6]和燃烧法[7]。一般情况下，使用水热法进行制备，再煅烧生成产物。但是，Y2O3纳米材料还存在一些有待解决的问题，如制备时所需的煅烧温度较高[8]、由氢氧化物制备氧化物的情况居多[9-10]、会使反应物有残留、产物不纯以及光稳定性不佳等，使其在实际应用中受限很大。此外，纳米材料有很多传统的微米尺寸荧光材料没有的优势，这些性质大多数与颗粒的大小等性质密切相关。通过改变某些反应条件，会对化合物的各种性质产生影响。因此，有必要对纳米发光材料的制备过程进行优化，以得到各种应用中所需要的不同性质的纳米粒子。

目前，Y2O3已经应用于很多领域，例如陶瓷[11]、半导体[12]、催化剂[13]和生物探针[14]等。已有研究表明Y2O3上转换发光材料可以用于骨修复材料[15]，且Y2O3:Yb，Er纳米粒子有优异的光学性质和稳定性，说明Y2O3:Yb，Er在生物学有潜在的应用价值。而细胞和Y2O3:Yb,Er纳米粒子之间的生物相容性是纳米粒子应用于生物学的重要参数。因此，研究其生物学性质具有很深远意义。

本文以硝酸钇和尿素为主要原料，用水热-煅烧两步法对制备Y2O3:Yb,Er纳米粒子的条件进行优化，得到最优条件下制备的Y2O3:Yb,Er纳米粒子，并对其进行了生物学性质探究，为其在生物学领域的应用提供一些依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

尿素（AR，国药集团化学试剂有限公司）；硝酸钇（AR，阿拉丁试剂有限公司）；硝酸镱（AR，西格玛奥德里奇贸易有限公司）；硝酸铒、十六烷基三甲基溴化铵（AR，阿达玛斯试剂有限公司）；无水乙醇（AR，常熟市杨园化工有限公司）。

Nano-ZS纳米粒度与电位分析仪，英国马尔文仪器有限公司；Avatar380红外光谱仪，美国热电集团；D/max-2550PC X射线粉晶衍射光谱仪，日本Rigaku；FLS-1000荧光光谱仪，天美科学仪器有限公司；JSM-5600LV场发射扫描电镜，日本JEOL；酶标仪，Multiskan Sky；SP8 共聚焦荧光显微镜，德国 Leica。

1.2 实验方法

1.2.1 Y2O3:Yb,Er纳米粒子的制备

室温下，将 0.319 2 g 硝酸钇、0.086 2 g 硝酸镱和0.006 9 g硝酸铒溶于30 mL去离子水中，再将0.182 2 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）和1.201 2 g尿素加入去离子水中继续溶解。然后将此溶液倒入反应釜中，水热法在160 ℃下反应3 h；冷却后取出，用去离子水和乙醇反复洗涤，然后离心、干燥。最后将所得产物在600 ℃下煅烧2 h后得到Y2O3:Yb,Er粉末。

改变水热法反应物温度（130～200 ℃，10 ℃一个梯度），得到不同温度条件下制备的Y2O3:Yb,Er纳米粒子。

用吐温80取代CTAB作为表面活性剂，或不添加表面活性剂，制备Y2O3:Yb,Er纳米粒子。

改变煅烧温度（200～800 ℃，100 ℃一个梯度），得到不同煅烧温度条件下的Y2O3:Yb,Er纳米粒子。

1.2.2 细胞毒性实验

实验选用Y2O3:Yb,Er纳米粒子为试样，Hela细胞为受体。将HeLa细胞以每孔5 000个细胞的密度接种在1640培养基（RPMI-1640,含10%FBS）的96孔板中，并生长24 h。添加新鲜培养基中浓度为0.7～200 μg/mL的Y2O3:Yb,Er纳米粒子作为替代品，并将细胞孵育24 h。然后除去工作溶液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。将总计10 μL的CCK-8（Cell Counting Kit-8，BIOMIKY）添加到每个孔中，并将细胞在5%的CO2湿润的气氛中于37 ℃进一步孵育 1 h。将板摇动 5 min，并使用酶标仪在 450 nm处测量吸光度。

1.2.3 细胞成像实验

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用1640完全培养基培养，在玻底皿中接种30 000个Hela细胞。将玻底皿置于培养箱中在37 ℃、5% CO2的 条 件 下 培 育 24 h。Hela细 胞 首 先 用Y2O3:Yb,Er纳米颗粒（事先用聚乙二醇修饰）在37 ℃、5% CO2的环境中染色12 h。用PBS洗皿两次，然后用4%的多聚甲醛固定20 min，细胞核染料4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，0.08 μg/mL）随后孵化 30 min。最终用盛着PBS的玻底皿在激光共聚焦荧光显微镜下进行成像。

2 结果与讨论

2.1 Y2O3:Yb,Er制备条件的优化

2.1.1 反应温度对Y2O3:Yb,Er纳米粒子的影响

图1为不同反应温度下制备的Y2O3:Yb, Er纳米粒子与标准卡片的XRD对比图。从图中可以看出，不同温度下制得的Y2O3:Yb, Er纳米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相，证实了Y2O3:Yb, Er纳米粒子的形成。

图1 不同反应温度下制备的Y2O3:Yb,Er纳米粒子XRD图及与标准卡片的对比

图2为不同反应温度下制备的Y2O3:Yb,Er纳米粒子的荧光谱图。从图中可以发现，在130～160 ℃范围内，随着反应温度的升高，Y2O3:Yb,Er纳米粒子的荧光强度呈现增强的趋势，160 ℃时，Y2O3:Yb,Er纳米粒子的荧光强度最强，随着温度继续升高，Y2O3:Yb,Er纳米粒子的荧光强度呈现减弱的趋势。这可能是因为Y2O3形成之前为带结晶水的碳酸钇[16]，一般情况下，温度超过200 ℃后，结晶水就已经完全消失[17]。说明在超过一定温度时，会破坏前驱体的结构，致使煅烧后产生不利影响，导致荧光强度的降低。

图2 不同反应温度下制备的Y2O3:Yb,Er纳米粒子荧光图及最大荧光强度变化趋势图

2.1.2 不同表面活性剂对Y2O3:Yb,Er纳米粒子的影响

图3为不同表面活性剂下制备的Y2O3:Yb,Er纳米粒子的与标准卡片的XRD对比图。从图中可以看出，不同表面活性剂下制得的Y2O3:Yb,Er纳米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相，证实了Y2O3:Yb,Er纳米粒子的形成。

图3 不同表面活性剂下制备的Y2O3:Yb,Er纳米粒子的XRD图及与标准卡片的对比

图4为不同表面活性剂下Y2O3:Yb,Er纳米粒子的荧光图谱。从图中可以看出，发射峰基本在同一个位置，没有变化，发光最强的为以CTAB为表面活性剂制得的Y2O3:Yb,Er纳米粒子，以吐温80为表面活性剂时发光强度次之，当无表面活性剂时，发光最弱。因为氧化钇为无机晶体，吐温80作为非离子表面活性剂，游离在溶液中，难以与溶液中离子相结合，起到促进反应进行的作用。而CTAB为阳离子表面活性剂，可以与溶液中的阴离子结合，使表面活性剂中的氨基带上正电荷，促进反应进行。同时，加入表面活性剂之后，产物的分散性变好，缺陷较少，导致荧光强度变强。

图4 不同表面活性剂条件下制备的Y2O3:Yb,Er纳米粒子荧光图谱及SEM图：（a）无表面活性剂；（b）吐温80；（c）CTAB

图4中SEM图通过Nanometer软件计算得出，未加入表面活性剂时，产物的粒径为41.0 nm；加入吐温80时，产物的粒径为44.7 nm；加入CTAB时，产物的粒径为46.8 nm。加入表面活性剂之后，产物的粒径变大。联系其发光性能，可以看出，大的颗粒，晶体的完整性好，发光能力更强；从无表面活性剂到非离子型表面活性剂再到阳离子型表面活性剂，所形成的颗粒变大，可能与其在正生长的粒子表面的吸附能力差异有关[18]。

2.1.3 不同煅烧温度对Y2O3:Yb,Er纳米粒子的影响

图5为不同煅烧温度下制备的Y2O3:Yb,Er纳米粒子与标准卡片的XRD对比图。从图中可以看出，不同煅烧温度下制得的Y2O3:Yb,Er纳米粒子的衍射峰都可以很好地指向Y2O3的立方相，证实了Y2O3:Yb,Er纳米粒子的形成。

图5 不同煅烧温度下Y2O3:Yb,Er纳米粒子XRD图及与标准卡片的对比

因为在500 ℃之前没有形成Y2O3，没有表现出发光性能，所以只能研究在500～800 ℃不同煅烧温度下荧光强度的变化。从图6中可以看出，样品随着温度的升高在600 ℃时表现出最佳的发光强度，然后随着温度的继续升高，荧光强度降低。可能是因为随着样品的结晶度降低和缺陷的存在，导致发光性能降低。

图6 不同煅烧温度下Y2O3:Yb,Er纳米粒子的荧光谱图

对不同煅烧温度下（200～800 ℃）的产物进行红外测试分析（图7），产物经500 ℃煅烧2 h后，在1 635 cm-1处 C=O[19]的吸收峰大大减弱。200～800 ℃煅烧后样品的红外光谱的峰位置没有太大变化，强度有所不同。这可能是因为晶粒大小的变化在红外光谱上体现的不太明显[20]，而表示碳酸的1 522 cm-1处的特征峰[21]和表示C-O的1 365 cm-1处的特征峰[22]的吸收强度先是随着煅烧温度的升高而逐渐减弱，到600 ℃以后，吸收峰的强度基本保持不变。这表明，碳酸的量先是随温度升高而减少，600 ℃后基本不变，并且吸收强度弱到几乎没有，而在562 cm-1处的峰，归属于Y2O3中Y-O[23]的特征峰，说明煅烧至600 ℃时前驱体已经完全转变为Y2O3，表明已经生成了Y2O3。

图7 不同煅烧温度下Y2O3:Yb,Er纳米粒子红外光谱

图8为煅烧前后Y2O3:Yb,Er纳米粒子的扫描电镜图（SEM），粒径测试结果为煅烧前平均粒径50.5 nm，煅烧后平均粒径32.85 nm，煅烧后粒子大小比前驱体小，且煅烧前后纳米粒子的形态良好。说明煅烧后Y2O3:Yb,Er纳米粒子也能保持一个良好的形态。

图8 煅烧前（a）和煅烧后（b）Y2O3:Yb,Er纳米粒子的SEM图以及粒径图

2.2 Y2O3:Yb,Er纳米粒子的生物学表征

2.2.1 Y2O3:Yb,Er的细胞毒性实验

图9为细胞孵育24 h后的细胞活性图，很直观地揭示了Y2O3:Yb，Er纳米粒子的细胞毒性。分析对照组和空白组可知，当Y2O3:Yb,Er的浓度高于200 mg/mL时，细胞存活率依然大于85%。与传统的荧光标记物如有机染料、半导体量子点相比，Y2O3:Yb,Er纳米粒子的毒性很小，体现出良好的生物相容性，说明Y2O3:Yb,Er对细胞的损伤较小。

图9 不同浓度Y2O3:Yb,Er对细胞存活率的影响

2.2.2 Y2O3:Yb,Er的细胞成像实验

图10（a）是DAPI染色的细胞核，图10（b）是Y2O3:Yb,Er纳米粒子在 980 nm 激发下，500～800 nm范围内的荧光图像，图10（d）是将图10（a）和图10（b）结合在一起的图片，从图10（d）中可以看出Y2O3:Yb,Er纳米粒子已经被细胞吞噬，并包裹在细胞核周围，说明Y2O3:Yb,Er纳米粒子有良好的的生物相容性，可以应用于生物学领域。

图10 Y2O3:Yb,Er的细胞成像图：（a）DAPI，0.08 mg/mL；（b）Y2O3:Yb,Er荧光伪彩图像（500～800 nm），980 nm激发；（c）明场图片：（d）a和b的合并图像

3 结论

用水热-煅烧两步法制备的Y2O3:Yb,Er纳米粒子平均粒径为32.85 nm。Y2O3:Yb,Er纳米粒子在600 ℃煅烧下拥有良好的晶型和发光强度，比一般文献中报道的煅烧温度都低。此外，Y2O3:Yb,Er纳米粒子几乎没有细胞毒性，并且具有很好的生物相容性，这对Y2O3:Yb,Er纳米粒子在生物学领域的应用提供了一定的价值。