油/水界面法制备硫化铜微粒及其抗菌性能研究

齐嘉欣，温金熙，汪沁，周兴平

（东华大学化学化工与生物工程学院，上海201620）

微生物感染是现代医学所面临的极其严峻的问题之一[1]，在人体生物材料植入、医用材料使用等环节都有因细菌感染而产生严重后果的案例[2-5]，因此研发具有良好抗菌性的生物医用材料能够在一定程度上解决因细菌感染所带来的医学问题[6]。

金、银、锌和铜等金属粒子广泛应用于医疗器械、农业、诊断等领域[7-8]，其抗菌广谱、毒性小且抗菌性能持久[9]，在抗菌材料的制备中具有重要的应用价值。在常用的抗菌性金属粒子中，铜的抗菌性相较金、银略差且极易被氧化[10]，但是铜价格便宜且易制成含铜化合物。同时硫元素也能够对细菌表现出良好的抗菌性，因此制备CuS作为抗菌材料受到了研究者们的极大关注[9]。

目前各种方法所制备的CuS微粒均为六方晶型，对于其他晶型CuS的制备及其抗菌效果的研究较少，因此探究不同晶型CuS的抗菌性能具有重要意义。

本研究采用油/水界面法合成CuS微粒，通过改变反应条件，得到不同晶型的CuS微粒，并测试其对金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli）的抗菌活性，期望能够扩大其在生物医学领域的应用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试剂：氯化铜（CuCl2·2H2O，99.0%，国药集团化学试剂公司）、油酸钠（99.0%，国药集团化学试剂公司）、硫化钠（Na2S·9H2O，99.0%，国药集团化学试剂公司）、甲苯（99.0%，国药集团化学试剂公司）、无水乙醇（99.7%，国药集团化学试剂公司）；超纯水和去离子水为自制。

仪器：Hitachi S-4800型扫描电子显微镜（SEM，日 本 日 立 HITACHI），Rigaku D/max-2500型 X 射线衍射仪（XRD，日本Rigaku），力辰DF-101S型磁力搅拌器(力辰仪器科技有限公司)，Centrifuge5810型高速离心机（德国艾本德股份有限公司），YXQLS-S型全自动高压蒸汽灭菌锅（上海博迅生物仪器股份有限公司），SW-CJ-2FD型双人超净工作台（聚创环保设备有限公司），HYG-B型全温控制摇瓶柜（苏州培英实验设备有限公司），9080型隔水式恒温培养箱（华城敏科实验仪器厂）。

1.2 样品的制备

油 酸 铜 的 合 成：将 0.02 mol CuCl2·2H2O 和0.04 mol油酸钠溶于正己烷、无水乙醇、超纯水体积比为3∶4∶7的混合溶剂中，70℃下回流反应4 h，反应结束后置于冰浴中冷至0℃，分离析出物，去离子水与无水乙醇交替洗涤，真空干燥，得到绿色的油酸铜产物。

CuS微粒的合成：将0.004 mol油酸铜溶入100 mL甲苯中，0.004 mol Na2S·9H2O 置于 100 mL 去离子水中溶解并逐滴加入到上述含有油酸铜的甲苯溶液中，置于反应釜中分别在120℃和180℃下反应5 h，待反应结束后，分离、洗涤、60℃真空干燥，分别得到六方相和正交相的球状CuS微粒。

1.3 样品的抗菌性测试

实验选择两种菌种，革兰氏阳性菌S.aureus和革兰氏阴性菌E.coli。

（1）菌悬液制备：用接种环挑取一个菌落，置于装有液体培养基的锥形瓶中充分涮洗，锥形瓶封口后置于37℃摇床中培养12 h，稀释适当倍数。

（2）试样制备：分别称取0.01 g不同晶型的CuS粉末于各样品瓶中，向其中加入4.9 mL的PBS和100 μL的预制菌液。对照组为空白对照，即只加入4.9 mL的PBS和100 μL的预制菌液。将样品瓶固定在恒温振荡培养箱的摇床上，37℃培养12 h。

（3）活菌计数培养：试样和对照试样振荡培养后，适当稀释，分别取10 μL样液在3个灭菌平皿中平行接种，待凝固后将上述平板置于恒温培养基中培养10 h后进行菌落计数，并计算抑菌率C。

式中C为抑菌率，a为对照试样的平均活菌数，z为待测试样的平均活菌数。

2 结果与讨论

2.1 CuS微粒的XRD表征

图1为油/水界面法分别在120℃和180℃下反应5 h所制备的CuS微粒的XRD图谱。从图中可以看出，在120℃下反应5 h所制备的CuS微粒的衍射峰对应PDF标准卡片06-0464，即在此条件下反应得到的产物是六方相CuS；在180℃下反应5 h所得到的CuS微粒为正交相CuS，其衍射峰则对应正交相CuS的标准PDF卡片65-7111。

图1 CuS微粒的XRD图

2.2 CuS微粒的SEM表征

图2是在120℃和180℃下分别制备的六方相和正交相CuS微粒的SEM图。由图可以看出，所制备的六方相CuS为极细的纳米片组装而成的微球颗粒，平均粒径为1.25 μm，纳米片厚度约70 nm，微球表面粗糙、大小均匀；正交相CuS颗粒也是由纳米片组装成的微球颗粒，平均粒径为1.24 μm，纳米片较六方相CuS微球的纳米片厚，约130 nm。

2.3 CuS微粒的抗菌性

样品对S.aureus和E.coli的抗菌试验结果如图3、图4所示。

图2 六方相CuS微粒（a）和正交相CuS微粒（b）的SEM图

图3是S.aureus分别与正交相、六方相CuS微粒接触10 h后的菌落照片。由图可以看出，10 h接触过后，菌落数相较于空白对照组明显减少，可以说明两种晶型的CuS微粒对于金黄色葡萄球菌均表现出较好的抗菌性能。

图3 S.aureus与CuS微粒接触10 h后的菌落照片

图4是E.coli分别与正交相、六方相CuS微粒接触10 h后的菌落照片，从中可以看到，经过10 h接触，试验组的菌落数同样明显少于空白组，说明两种晶型的CuS微粒对于E.coli也表现出优异的抗菌性能，尤其是正交相CuS微粒对于E.coli的抗菌效果非常明显。

图4 E.coli与CuS微粒接触10 h后的菌落照片

对样品抗菌性能定量分析的抑菌率结果统计如图5所示。从图5可以看出，油水界面法制备的正交相CuS微粒对S.aureus和E.coli的抑菌率分别为99.6%±1.5%、100%；六方相CuS微粒对S.aureus和E.coli的抑菌率分别为97.4%±4.7%、85.9%±11.1%。

3 结论

本文通过油/水界面法分别在120℃和180℃下成功制备出了结晶性良好的六方相和正交相CuS微粒，均为纳米片堆叠而成的微球结构。六方相和正交相CuS微粒对E.coli和S.aureus均具有非常优异的抗菌性能，对于抗菌材料的探索具有一定的意义。

图5 E.coli和S.aureus与试样接触培养10 h后的抑菌率统计