小鼠睾丸特异表达新基因LRRC34的分子克隆技术研究

徐帅，郝琴，陈宏波，向阳*

（1.湖南省汨罗市食品药品检验所，湖南岳阳 414400；2.湖南理工学院，湖南岳阳 414006）

随着生物研究的深入，人类和各种动植物基因组序列被预测出来，致使更多的基因信息被释放出来，基因功能的研究也就越来越重要[1]。现如今男子精子的数量和质量呈现明显下降趋势，导致不育的情况多样且复杂，生殖相关基因的突变引起的男性生殖功能障碍是目前研究的热点问题之一[2]。在睾丸中表达的基因众多，依然有许多未知基因参与精子发生的调控，发现和研究睾丸特异性基因是一项重要的研究工作[3]。研究表明含LRR结构域的蛋白质主要在各种细胞的信号传递、RNA加工、细胞周期调控、细胞凋亡和转录调控等方面起作用[4-5]，因此本研究通过生物信息学方法将克隆重叠群中的EST序列经修正和拼接后得到一个新的睾丸表达基因LRRC34，通过基因克隆技术进一步对这个新基因进行研究分析，确认该基因是否参与精子发生的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

多只成年KM小白鼠，总RNA抽提试剂盒购自于Omega公司；逆转录试剂盒购自于Fermentas公司；PCR扩增试剂盒购自于Thermo Scientific公司；质粒DNA抽提试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、Solution I连接试剂盒、T4 DNA连接酶、pMD18-T载体和DNA链接试剂盒均购自TaKaRa公司；电泳试剂、Trizol、LB培养基试剂、DEPC等试剂和普通Taq DNA聚合酶均购自于上海生物工程公司；SUPERSCRIPTTMⅡ逆转录酶购自于GIBCO BRL公司；50×Advantage 2高保真DNA聚合酶购自于Promega公司；dNTP mix、DNase I均购自于 MBI公司；氨苄青霉素Amp和卡那霉素Kan、CaCl2均购自于BIOSHARP公司进口分装；琼脂糖和染色剂EB均购自于BIOWEST 公司；DL3000 DNA Marker为北京天根生化科技公司产品；E.coli Top10为大肠杆菌细胞株系，为本实验室分离纯化后而保存的菌株。RT-PCR中阳性对照GAPDH引物与小鼠LRRC34克隆引物均委托上海生工生物工程股份有限公司合成[6-7]。

1.2 实验方法

1.2.1 生物信息学分析

利用NCBI网站找到多个EST序列片段，通过拼接技术获得一个新基因，再利用Translate软件把核酸序列翻译成蛋白质序列，再采用NCBI中的ORF finder进行阅读框架的识别并用RT-PCR对该阅读框架进行验证；采用NCBI中的BLAST进行核酸和蛋白质序列相似性比对；应用NCBI中的Map View软件进行染色体定位；采用Webcutter 2.0软件进行酶切位点分析，并设计出构建表达载体的引物；采用GENESCAN和FGENEH等基因预测软件进行内含子和外显子分析；采用ExPASy服务器中的ProtParam tool和TMpred软件分别进行蛋白质理化性质、跨膜区和疏水性分析；利用ExPASy中的SignalP V1.1进行信号肽序列分析[7]。

2.2.2 小鼠多组织总RNA抽提

采用Trizol法提取总RNA：扯尾压颈法快速处死成年雄性和雌性小白鼠各一只[8]；解剖小白鼠，分别取睾丸、附睾、肾脏、大脑、小脑、心脏、肺、肝、大肠、小肠、尾巴、耳朵等组织并用Trizol法提取各组织的总RNA。提出各组织总RNA后再用逆转录试剂盒将其转录成cDNA第一链接。

1.2.2 RT-PCR扩增LRRC34新基因全长

根据拼接后得到的小鼠LRRC34基因cDNA序列在阅读框两侧设计引物对，其上游引物可设计为LRRC34-F：5'z-GGCGGCCTTCCTCTTTAGA-3'； 其 下游引物可设计为LRRC34-R：5'-TTCTGTGGCTTGTTTCAGGG-3'；扩 增 产 物 大 小 为 1 557 bp。 同 时 管家基因GAPDH设计的上游引物GAPDH-F：5'-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3'；设计的下游引物为GAPDH-R：5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'；扩增产物大小为499 bp，用来做RT-PCR阳性对照。

以Trizol法提取的大鼠多组织mRNA为模板，逆转录合成cDNA第一链，分别用GAPDH和LRRC34的引物作为引物进行RT-PCR扩增。以睾丸cDNA第一链为模板进行PCR扩增，在10 μL的体系中加入以下物质：ddH2O7.1 μL，10×buffer（无 Mg2+、KCl）1.0 μL，dNTP Mix（10 mmoL/L）0.5 μL，Primer LRRC34-F 0.2 μL，Primer LRRC34-R 0.2 μL，睾丸 cDNA 第一链（模板）0.8 μL，Mg2+0.7 μL，Taq DNA 聚 合 酶 0.2 μL。 在 2720型 PCR 仪（Applied Biosystems公司，美国）完成PCR扩增，经过多次PCR摸索，反应条件如下：先95 ℃预变性3 min；再95 ℃变性 30 s，62 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，完成 35 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min，置于 4 ℃保温。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测cDNA第一链效果并分析。其次再用高保真DNA聚合酶进行LRRC34基因的高保真PCR扩增。将高保真PCR产物连接到pMD18-T Vector Kit载体上，转化到E.coliTop10 大肠杆菌，将阳性克隆菌液发送到上海生工生物工程股份有限公司测序分析[6-7]。

1.2.4 多组织RT-PCR

以小鼠睾丸、肾脏、附睾、大脑、小脑、心脏、肺、肝、大肠、小肠、尾巴和耳朵等多组织mRNA为模板利用逆转录试剂盒逆转录成多组织cDNA第一链，然后用多组织cDNA第一链为模板进行多组织RT-PCR，反应体系和实验方法与1.2.3相同，得到的克隆产物再用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测基因LRRC34在小鼠不同组织中的表达水平[6]。

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析结果

经生物信息学分析，LRRC34基因定位于小鼠3号染色体，并且含有11个外显子，10个内含子。该基因的cDNA全长序列为1 840 bp，其中开放阅读框为1 248 bp，编码了一个含有415个氨基酸残基的蛋白质。在161～163核苷酸位置有一个起始密码子ATG，在1 406～1408核苷酸位置有一个终止密码子TAA。ORF起始处序列为tcgATGg，符合Kozak规则，在序列的3'端则有一个加尾信号AATAAA，内含子与外显子界限的划分符合典型的GT/AG规则。

2.2 小鼠多组织RT-PCR扩增

如图1示，利用管家基因GAPDH的引物和多组织cDNA第一链接为模板进行PCR扩增来检测cDNA第一链的效果。克隆产物片段长度约为500 bp，与管家基因GAPDH预期片段长度499 bp基本相符，说明用小鼠多组织mRNA逆转录合成cDNA第一链非常成功，其中睾丸组织cDNA可以直接作为扩增LRRC34基因的模板，而其他cDNA第一链也可以做不同组织的表达差异的PCR反应模板。

图1 RT-PCR检测小鼠多组织cDNA第一链

2.3 克隆LRRC34基因

通过改变退火温度进行最佳条件的探索，得到该基因的最佳退火温度为62 ℃，在最佳PCR克隆条件下对LRRC34基因进行PCR扩增（如图2示）。从图2中可看到，小鼠睾丸组织扩增出特异性产物，且基因片段长度在 1 000～2 000 bp 之间，这与 LRRC34基因预期片段长度1 557 bp大体相符，说明该基因确实在小鼠睾丸组织中有表达，LRRC34基因被成功地扩增。将克隆产物连接到pMD18-T Vector Kit载体上，经测序，结果与序列完全一致，说明拼接序列是正确的。然后将含有LRRC34基因T载体的E.coli Top10菌液培养，抽质粒保存在超低温冰箱用于做后续实验。

图2 小鼠睾丸组织克隆LRRC34基因

2.4 基因LRRC34在小鼠不同组织中的表达水平

以逆转录合成的小鼠多组织cDNA第一链为模板，用LRRC34的设计的引物作为引物，使用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增LRRC34基因（如图3示）。从图3可看到，LRRC34基因仅在小鼠睾丸组织中有表达，而在小鼠其他组织中均不表达，从这一点说明LRRC34基因具有组织特异性，故而可以推断LRRC34基因是睾丸特异表达基因。

图3 基因LRRC34在小鼠不同组织中的表达水平

3 讨论

近年来，男性生殖域基因功能的研究是男性科学研究的热门领域之一[2]。而研究精子发生机制与发现特异性睾丸表达新基因也是研究的重点。由于人类基因图谱已经出来，而人类基因大约在3万～4万个，且并不是每个基因都在人体表达[9]，如果要研究生殖域基因功能，可以通过生物信息学方法将该克隆重叠群中的EST序列经BLAST修正后进行拼接获得一个新的未知序列，寻找新的组织特异性EST，从而可以找到生殖域表达的特异新基因，为科研工作提供一种简单便利的新方法[10-11]。

本研究根据获得的序列设计引物对，以大鼠睾丸组织cDNA文库为模板进行扩增，克隆出了一个新基因LRRC34，基因产物为睾丸生精细胞凋亡相关蛋白。综合运用NCBI数据库中的BLAST和Expasy中的TMpred、Protparam tool等软件较全面地分析了该基因的生物信息：LRRC34基因的cDNA全长序列为1 840 bp，其中开放阅读框为 1 248 bp，编码了一个含有415个氨基酸残基的蛋白质；将LRRC34基因cDNA序列与小鼠基因组序列比较，发现该基因定位于大鼠3号染色体，并且含有11个外显子，10个内含子。LRRC34基因在大鼠多组织中的RT-PCR结果显示：该基因仅在正常成年雄鼠睾丸组织中特异性高表达，而在小鼠其他组织中均无明显表达。说明LRRC34基因具有组织特异性，故而可以推断LRRC34基因是睾丸特异表达基因，该基因与生殖及精子发生有关，其可能在睾丸发育和精子形成的过程中起重要作用。生物信息分析表明LRRC34基因与人类同源基因相似性达78%，因此可以通过对小鼠LRRC34基因的研究来初步预测人的部分性状，为人类雄性精子发生的分子机制和生精细胞凋亡的生理机制的研究提供理论依据，同时对相关疾病的诊断、治疗也具有十分重要的现实意义。

本研究中所克隆的基因LRRC34只在小鼠睾丸组织特异性表达，其极可能与小鼠生精细胞凋亡密切相关，虽然要弄清LRRC34基因与生精细胞凋亡的关系还有待于进一步的实验研究，但这些结果为后续研究生殖领域新基因生精细胞凋亡的分子机制提供了新思路，展示了新途径。