环磷酰胺对MFC荷瘤小鼠影响的1H NMR代谢组学初步研究*

陶柱萍，厉 颖，常 旭，欧红利，江 伦，王雪雪，李灿委，范孟然，刘卫红，白 丽，高鹏飞1,2,

(1 药用特种昆虫开发国家地方联合工程研究中心，云南 大理 671000; 2 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000；3 大理大学药学与化学学院，云南 大理 671000；4 大理大学基础医学院，云南 大理671000；5 大理大学公共卫生学院，云南 大理 671000；6 大理大学 农学与生物科学学院，云南 大理 671000)

恶性肿瘤的死亡率高，预后差，严重威胁人类的健康，为患者、家属和社会带来严重的负担，其中胃癌是世界上最严重的恶性肿瘤之一，在全球癌症死亡率中居第三位[1-2]。

环磷酰胺(CTX)为烷化剂类抗肿瘤药，也是细胞毒性免疫抑制药[3]。它可以抑制细胞的DNA合成，干扰细胞的增殖，抑制抗体形成等[4]。CTX进入体内被肝脏或肿瘤内存在的过量磷酰胺酶或磷酸酶水解，转变为活化作用的磷酰胺氮芥而起作用[5]。

近年来，代谢组学作为一种新兴的“组学”技术，已成功地应用于各种系统生物学领域，分析疾病治疗过程中生物体系内发生的代谢物和代谢通路的改变，从整体角度研究生物体的功能水平[6]。由于核磁共振(NMR)技术具有高通量、无创性和良好的重现性及前处理简单等优点[7]，以1H NMR为基础的代谢组学技术已广泛应用于肿瘤差异代谢物的鉴定、监测以及抗肿瘤药物的研究[8]。目前，CTX广泛应用于临床的抗肿瘤治疗，关于CTX抗肿瘤作用的代谢组学研究报道较少，本研究主要从代谢组学的角度探究CTX的抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试验药物与试剂

环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司；磷酸二氢钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；磷酸氢二钾(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 细胞株

MFC小鼠胃癌细胞，取自615小鼠胃癌组织，属于上皮肿瘤细胞系，呈贴壁生长，购于中国科学院细胞库。

1.1.3 动 物

6～8周龄SPF级Balb/c小鼠，每只20 g左右，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，SYXK(湘)2016-0002。

1.1.4 仪 器

核磁共振仪(Bruker 800 MHz)，瑞士Bruker公司； CO2培养箱(MCO-18AIC)，SANYO 公司；组织破碎仪(MICCRA D-1)，迈卡莱客(广州)工业技术有限公司；低温高速离心机(SIGMA 3-15)，西格玛实验室离心机公司；真空离心浓缩仪(LABCONCO CentriVap)，北京照生行仪器设备有限公司；冷冻干燥机(GOLD-SIM)，金西盟(北京)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MFC细胞体外培养

取MFC细胞株常规复苏，用10% FCS-RPMI-1640完全培养基培养，获取对数生长期的细胞，用无菌PBS调整将MFC细胞悬液调为1×107mL-1的浓度后备用。

1.2.2 分组及给药

将小鼠随机分为模型组和CTX给药组，每组6只。75%酒精消毒小鼠右侧腋下，棉球擦干后进行皮下注射0.2 mL MFC细胞悬液。于接种肿瘤后次日开始给药，模型组灌胃给予生理盐水(20 mL/kg)，1次/日；CTX给药组腹腔注射给予CTX(45 mg/kg，10 mL/kg)，1次/2日，共给药10天。

1.2.3 样品的收集与处理

小鼠末次给药24 h后，颈椎脱臼处死，收集小鼠肝脏组织，取肝脏0.1 g加入冰甲醇/H2O(2:1)溶液匀浆，离心后取上清，并用真空离心浓缩仪浓缩，随后置于冷冻干燥仪中冷冻干燥得冻干粉。加入K2HPO4/NaH2PO4缓冲液，涡旋混匀，低温离心取上清于-80 ℃保存用于NMR检测。

1.2.41H NMR 图谱采集与分析

小鼠肝脏图谱选用BRUKER 800 MHz核磁共振仪进行采集。对所有1H NMR 图谱用Topspin软件(Bruker biospin, Germany)进行傅里叶转换以及相位、基线调整，以TSP(δ=0.000)为标准对谱图进行化学位移的校正。运用AMIX(Bruker biospin, Germany)软件去除水峰的区域，并对图谱进行分段积分，将所产生的所有积分数据进行归一化。

归一化后的数据导入SIMCA-P 13.0(Umetrics，瑞典)软件，进行多元统计分析，包括非监督型主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)和监督型偏最小二乘判别分析(Partial Least-Squares Discriminant Analysis，PLS-DA)、正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal Partial Least-Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA)，结合人类代谢组数据库(Human Metabolome Database，HMDB)和相关文献，确定潜在的差异代谢物。

2 结 果

2.1 1H NMR 多元统计分析

图1 PCA图(A)、PLS-DA图(B)、200次置换实验图(C)和OPLS-DA (D)Fig.1 PCA (A), PLS-DA (B), scores plotspermutationtests with 200 iterations (C) and OPLS-DA (D) in 1 H-NMR spectra in liver tissue of mice

采用PCA对所有肝脏样品1H NMR代谢轮廓进行分析，模型组和CTX给药组的得分图如图1A所示，各组间呈现聚类现象，但聚类效果不明显，故进一步采用PLS-DA分析(图1B)。相应的200次排列实验如图1C所示，排列实验结果显示数据模型成立。基于肝脏代谢图谱的OPLS-DA分析，有助于分离不同组间的主要代谢物，最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异，寻找出具有特征性的差异代谢物。OPLS-DA得分图如图1D所示，可以看出模型组与CTX给药组沿t[1]轴分开，组间区分明显，说明两组小鼠的肝脏具有代谢差异。

2.2 潜在代谢差异物的确定

根据OPLS-DA分析，结合HMDB和相关文献初步分析，得到6个潜在肿瘤代谢差异物(见表1)，这些差异代谢物主要归属于氨基酸代谢、能量代谢、核酸代谢和脂质代谢，其代谢通路图如图2所示。

表1 小鼠肝脏提取物代谢谱中主要代谢物的变化

注：“↑”表示CTX组相对于模型组表达上调；“↓”表示CTX组相对于模型组表达下调。

图2 肝脏提取物中差异表达代谢物的代谢通路Fig.2 Metabolic pathways of differentially expressed metabolites in liver extract

3 讨 论

肿瘤的发展和进展往往伴随着体内内源性代谢物质的变化，而代谢组学可检测生物过程的最终产物，监测所有影响因素的整体结果，越来越多的研究利用代谢组学检测肿瘤的代谢，分析识别在肿瘤发生和发展过程中体内内源性代谢物质的改变和相关代谢通路的变化[10-11]。近年来，肿瘤代谢研究又有了新的进展，特别是两个突出的特点引起了人们的关注：Warburg效应：即使在氧气存在下，葡萄糖摄取率和乳酸分泌也会增加；谷氨酰胺依赖：高的谷氨酰胺摄取率是细胞生长所必需的[12]。通过代谢组学研究体内内源性代谢物质的变化，发现肿瘤生物标志物，可以深入探索肿瘤的病理机制，用于肿瘤的诊断和治疗。

1959年，CTX被美国FDA批准为抗癌药上市，抗瘤谱广，是目前临床广泛应用的抗瘤药物，它在体外无抗肿瘤的活性，进入体内经一系列代谢后，其中的磷酰胺氮芥发挥主要的抗肿瘤作用。

已有报道利用蛋白质组学和基因组学，研究与CTX相关的基因和蛋白表达谱的化学免疫治疗机制。研究表明，CTX治疗可调节大约1000个基因的表达，这些基因与DNA损伤、压力、细胞死亡、危险信号、模式识别受体(PRRs)、细胞因子、趋化因子和趋化因子受体有关。CTX还可诱导血浆中多种细胞因子、趋化因子和生长因子的释放[9]。但基因表达、蛋白质表达和代谢的时间尺度不同，找到因果联系较为困难。

为进一步了解CTX对体内内源性代谢物的影响，深入探索CTX对MFC荷瘤小鼠的物质基础及作用机制，本实验对MFC荷瘤小鼠和CTX给药后的小鼠肝脏进行了1H NMR代谢组学的初步比较分析。实验结果显示，和模型组相比，CTX给药组的肿瘤块明显变小；经分析内源性差异代谢物，得到6个潜在的肿瘤差异代谢物，进而初步揭示CTX抗肿瘤的作用机制可能与氨基酸代谢、能量代谢、核酸代谢和脂质代谢密切相关。胃癌多数情况下是一种“发现即晚期”的病症，早期诊断显得尤为重要；肿瘤生物标志物是可以提示肿瘤存在并反映其一定生物特性的生化物质，这6个潜在的肿瘤差异代谢物在胃癌的诊断治疗中有一定的临床意义和应用价值。

肿瘤的生长对肝、脾、肺、肾、心脏等许多非累及器官的代谢功能会产生影响。肝脏是机体内源性和外源性物质代谢和沉积的重要器官，当其受到损害时，必定会引起相关代谢网络变化，并引起全身代谢紊乱[13]，故本研究选用肝脏样品进行代谢组学研究。本研究结果显示，CTX的抗肿瘤作用可能与调节氨基酸代谢、能量代谢、核酸代谢和脂质代谢通路有关。

3.1 氨基酸代谢

肝脏是氨基酸代谢的主要场所，氨基酸是合成蛋白质所需的基本物质，可用于合成癌细胞生长和增殖所需的蛋白质和核苷酸，恶性肿瘤患者体内常出现氨基酸代谢异常的现象[14]。此外，氨基酸是癌细胞自体合成嘌呤和嘧啶的前体物质。

脯氨酸与羟脯氨酸等氨基酸是胶原蛋白富含的氨基酸，羟脯氨酸是一种非必需氨基酸，其含量的变化是衡量机体胶原组织代谢的重要指标[15]。Tsai等[16]采用LC-TOF-MS代谢组学技术研究发现，胃癌患者肿瘤组织中的脯氨酸水平降低。羟脯氨酸可由脯氨酸羟化而来，是由胶原和弹性蛋白等结缔组织蛋白质水解得到的一种氨基酸。在本研究中，与模型组相比，CTX给药组小鼠肝脏中羟脯氨酸的水平升高，提示CTX的抗肿瘤作用可能与调节氨基酸代谢有关。

3.2 能量代谢

丙酮酸代谢是细胞能量代谢的关键。与模型组相比，CTX给药组小鼠肝脏中，丙酮酸水平降低，说明能量代谢出现了变化。丙酮酸是糖酵解的中间产物，可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的互相转化。肿瘤细胞的Warburg效应可引起丙酮酸水平升高[17]。在本研究中，丙酮酸水平的降低提示糖酵解过程受到抑制。CTX可能通过抑制糖酵解，调节能量代谢，发挥其抗肿瘤作用。Zhang等[18]基于1H NMR 代谢组学技术分析胃癌患者和健康人的组织代谢差异物发现，胃癌患者肿瘤组织中丙酮酸水平升高。在本研究中，与模型组相比，CTX给药组小鼠肝脏中丙酮酸水平降低，提示CTX可能通过调节丙酮酸水平，从而调节能量代谢，抑制肿瘤生长。

3.3 核酸代谢

与模型组相比，CTX给药组小鼠肝脏肌苷和烟酰胺的水平升高，提示CTX给药组小鼠肝脏核酸代谢出现了变化，CTX可能通过调节核酸代谢抑制肿瘤生长。

研究报道，在肿瘤中肌苷水平显著下降，这可能是因为核酸的生物合成对DNA和RNA生物合成的需求增加，以确保在肿瘤生长过程中癌细胞的增殖[19]。本研究中，与荷瘤小鼠相比，CTX给药后小鼠肝脏肌苷水平明显升高。肌苷参与体内核酸代谢，能量代谢和蛋白质合成。肌苷可以直接透过细胞膜进入人体细胞，使处于低能缺氧状态下的细胞恢复正常水平，继续进行新陈代谢，并能活化丙酮酸氧化酶类，提高辅酶A的活性，具有激活细胞，刺激代谢等良好的作用。此外，肌苷是一种天然抗氧化剂，可以减少活性氧的生成，保护DNA免受活性氧物质诱导的氧化损伤[20]，有助于受损肝细胞功能的恢复。

烟酰胺是烟酸的酰胺形式，是人体合成辅酶 I 二氢尿嘧啶脱氢酶(Dihydrouracil dehydrogenase, NAD+)的前体物质，在糖酵解、柠檬酸循环和线粒体电子传递等基础能量代谢中起着不可或缺的作用[21]。靶向NAD+代谢可能抑制许多潜在的肿瘤发展和进展机制，包括增殖、存活、代谢适应、侵袭能力、与肿瘤微环境的异型相互作用以及包括DNA维持和修复在内的应激反应。

3.4 脂质代谢

胆碱是细胞生物膜的重要组成部分，甘油磷酸胆碱可转化为胆碱。与模型组相比，CTX给药组小鼠肝脏胆碱和甘油磷酸胆碱的水平升高，说明脂质代谢出现了变化。Wang等[22]利用基于1H NMR的代谢组学研究发现，胃癌患者组织中胆碱水平显著降低，提示胆碱可能为肿瘤细胞的快速增殖提供合成细胞膜的成分。CTX给药组小鼠肝脏胆碱水平升高，说明CTX可能通过调节脂质代谢抑制肿瘤生长。

4 结 论

CTX给药后，MFC荷瘤小鼠肝脏多种代谢物水平发生变化，提示CTX的抗肿瘤作用可能与调节氨基酸代谢、能量代谢、核酸代谢和脂质代谢等代谢通路有关，为后续研究提供参考。

本实验尚存在一定的局限性。本研究仅对MFC荷瘤小鼠和CTX干预10天的小鼠肝脏代谢物的变化进行研究，今后实验可以考虑，设置多个时间点收集肝脏样品，对其代谢物进行动态分析，从而得到更全面的代谢物变化信息。此外，本研究仅选用1H NMR进行分析，后续研究可结合其他代谢组学技术，如LC-MS，GC-MS等，将采用不同的代谢组学技术得出的结果进行相互验证。