鸡蛋卵转铁蛋白螯合铁及其对大鼠贫血模型的影响

付 星 李述刚 黄 茜 袁小军 胡明烨 马美湖*

（1 华中农业大学食品科技学院 国家蛋品加工技术研发分中心 武汉430070

2 湖北工业大学生物工程与食品学院 武汉430068）

铁缺乏可以引起缺铁性贫血，导致皮肤苍白、易疲劳、注意力分散、气促、心跳过速等症状。营养性缺铁贫血是当今世界上最常见的营养缺乏病之一，也是全球所瞩目的公共卫生问题之一，而患此病的人群主要是婴幼儿、发育期青少年和妇女[1-2]。缺铁性贫血对婴幼儿智力及行为发育的影响很大，研究表明患缺铁性贫血的儿童与正常儿童相比，排除出生、营养、父母智商和家庭环境等因素的影响，其智力行为发展指数也显著的低，且与贫血的程度、时间有着直接的关系[3]。口服铁剂是治疗缺铁性贫血的首选药物，而传统补铁剂中的多数均存在对胃、肠道有较大刺激性，且具有不同程度的铁腥味以及其它副作用，限制了它的使用[4-5]。随着新型补铁剂的开发，人们发现有机铁具有适口性好，副作用小，吸收率高，容易被人体吸收等特点，是一种优良的补铁剂[6]。例如：多糖螯合铁通过胃酸的作用释放铁离子后，以分子形式完整地被肠道吸收，多糖铁配合物受温度、pH等的影响小，研究结果显示多糖铁是一类很有前途的新型高效的口服补铁剂[7]。此外，还有血红素铁，主要存在于哺乳动物机体的携氧蛋白上，作为一种生物态铁可以促进骨髓造血，并对缺铁性贫血有良好的治疗效果，是至今人们发现的无毒副作用，补铁效果最好的治疗药物之一[8]。

卵转铁蛋白（Ovotransferrin）亦称卵伴白蛋白，是一种糖蛋白，属于转铁蛋白家族的成员，具有抗菌、抗病毒、免疫调节、抗癌和抗氧化等作用。蛋清中含有大量的卵转铁蛋白，而乳铁蛋白在乳中的含量甚微，且工业化难度较大。研究发现，卵转铁蛋白与乳铁蛋白具有非常近似的生物活性，此外在蛋白的分离纯化、理化性质与结构表征及体外抗菌、抑制游离基形成等方面的研究亦具有相似的地方[9]。临床实验证明，婴儿服用后并无异源蛋白常有的过敏等不良反应[10]。卵转铁蛋白是一种良好的食品因子和生物医药产品，可作为功能性添加剂添加到一些食品配方中，不会产生敏感的刺激性气味。卵转铁蛋白的每个分子中有2个配位中心可与铁、铜或锌等金属离子结合。它可用作开发新型生物补铁制剂，起营养保健的功效[11]。2003年，黄登宇等[12]以转铁蛋白为基础，研究高铁制剂对缺铁小鼠模型的影响，结果显示有一定的补血作用，同时可提高小鼠SOD活力。2010年，杜华英等[13]研究了卵转铁蛋白铁制剂用于恢复缺铁性贫血小鼠，显著效果。研究表明卵转铁蛋白不仅补铁效果好，而且不会引起毒副作用，已成为本领域的研究热点[13]。卵转铁蛋白结合的铁元素通过肠黏膜细胞可以直接吸收，生物利用率较高，不会对胃、肠道产生任何的刺激作用，是一类具有发展潜力的补铁剂。

本文以卵转铁蛋白结合三氯化铁为铁源，研究对缺铁性贫血大鼠的抗贫血功效，为新型卵转铁蛋白补铁剂产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

鸡蛋，购自九峰山养鸡场。大鼠，由华中农业大学兽医院提供。动物饲料，南通特洛菲饲料科技有限公司。

IF-5401荧光分光光度计，日本日立公司；DU700紫外-可见分光光度计，美国贝克曼库尔特有限公司；CR-400色度仪，日本柯尼卡美能达；Nexus 470红外光谱仪，美国梅特勤公司；NMI20-015V-I核磁共振成像分析仪，上海纽迈电子科技有限公司；JSM-6390LV扫描电镜，日本NTC；APA2000激光颗粒度分布仪，英国马尔文仪器有限公司；RE-2000E旋转蒸发仪，上海耀特仪器设备有限公司；Beta1-8 LD plus冷冻干燥机，德国Christ公司。

1.2 方法

1.2.1 卵转铁蛋白铁结合能力的测定 根据本实验室袁小军[14]的方法获得纯化卵转铁蛋白，将其溶于pH 8.0 20mmol/L的Tris-HCI缓冲液中配制成2%（质量分数）的卵转铁蛋白溶液。分别考察不同FeCl3·6H2O浓度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40mmol/L），不同pH缓冲体系（pH 5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 Tris-H3BO4），不同碳酸氢钠浓度（0，40，80，160mmol/L，）和不同温度（25，35，45，55，65，75℃）处理条件下，于465 nm处测定吸光值A。按照杜华英[15]的方法测定铁结合能力。铁饱和度根据铁离子含量推算，100%铁饱和度的卵转铁蛋白中铁含量1.45μg，并利用原子吸收分光光度法测定样品中铁的含量[16]。

1.2.2 不同干燥条件卵转铁蛋白补铁剂的制备在优化条件下结合铁的卵转铁蛋白溶液，经离心、透析后，于-20℃冰箱里冷却预冻，次日冷冻干燥。其工作条件为温度-50℃，真空度0.1Pa，36 h，结束后获得冷冻干燥卵转铁蛋白粉。喷雾干燥组样品的工作条件为进风口温度170℃，反应结束后获得喷雾干燥卵转铁蛋白粉。

1.2.3 卵转铁蛋白补铁剂的性质测定 分别采用快速水分测定仪、水分活度仪、UltraScan Pro高精度分光测色仪、APA2000激光颗粒度分布仪、核磁共振仪、红外光谱、JSM-6390LV扫描电镜测定卵转铁蛋白产品的含水量、水分活度、溶解性、色度、粒径分布、水分分布、功能化学键、微观结构等参数。

1.2.4 动物分组 SPF级雌性初断乳SD大鼠80只，21 d初断乳。分组：将大鼠平均分为6组，A组为正常组，B组为冷冻干燥卵转铁蛋白补铁剂组，C组为喷雾干燥卵转铁蛋白补铁剂组，D组为阳性对照组（硫酸亚铁组），E组为恢复组，F组为阴性对照组，在处理0，10，20，30 d时分别取材检测。

1.2.5 动物饲料及缺铁模型建立 普通饲料同样采用美国营养学会推荐的AIN-93G纯化饲料，低铁饲料将配方中的铁源去除。除正常组（A）外，其余每组（B、C、D、E、F）均喂养缺铁饲料和去离子水，当大鼠Hb含量低于90 g/L时即造模成功。

1.2.6 饲养与给药 所有大鼠均采用不锈钢笼饲养，动物房温度维持在（25±1）℃，相对湿度维持在50%，光暗周期为12 h。根据正常大鼠每日摄入铁量2.4mg/100 g bw，硫酸亚铁0.3 g/片，每片含铁60mg，B组和C组每天以40mg/100 g bw灌胃（按含铁量折算卵转铁蛋白质量），D组每天以硫酸亚铁12mg/100 g bw灌胃。A组和E组喂养正常饲料和正常饮水，其余各组（B、C、D、F）继续喂养缺铁饲料和去离子水。在药物处理0，10，20，30 d分别取材检测。

1.2.7 全血指标的测定 将采集的全血置于0.5 mL EDTAK2抗凝管中，反复颠倒5～10次。采血过程中血液保存于4℃冰箱，待全部动物采血完毕后于当天送至武汉广州军区总医院检验科。RBC、Hb、HCT、MCV、RDW、MCH均 使 用Sysmex xs-1000i全自动血液分析仪测定。

1.2.8 血清指标的测定 将采集的血液注入2 mL EP管中（不添加抗凝剂），于37℃恒温培养箱1 h，使其充分凝固，然后置于4℃冰箱中过夜，3 000 r/min离心20min，用1mL吸管小心吸取上清液，送武汉广州军区总医院检验科测定血清铁蛋白（SF）、血清铁含量（SI）、血清总铁结合力（TIBC）及血清转铁蛋白（TRF）。

1.2.9 统计学方法 全部试验数据使用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 卵转铁蛋白铁结合能力的优化

转铁蛋白是一种能转运Fe3+的铁结合蛋白，是一种非血红素结合铁的β-球蛋白，一个分子能可逆地结合2个Fe3+，同时结合2个CO32-或HCO3-，阴离子的结合与Fe3+的结合是协同的。理论上，1个卵转铁蛋白分子可以结合2个Fe3+。本试验研究了环境因素对卵转铁蛋白铁结合能力的影响，包括Fe3+浓度、pH值、热处理、NaHCO3的浓度。如图1所示，未加Fe3+时，A465为0.07，说明提取的天然卵转铁蛋白含有少量的铁。随着Fe3+浓度的增加，卵转铁蛋白的A465nm值增大，说明卵转铁蛋白逐渐被铁饱和。当Fe3+浓度增加到0.4 mmol/L后，A465nm增长趋缓。在中性和偏碱性环境中，卵转铁蛋白的铁结合能力较高。在转铁蛋白结构中，HCO3-和一些碱性氨基酸残基（如Arg121、Lys210）连接，起到一种增效阴离子的作用，使蛋白质组分与Fe3+的结合更加紧密[17]。NaHCO3浓度为120mmol/L时，HCO3-的协同增效作用较为有效，表明转铁蛋白的空穴部位已被HCO3-饱和，不再体现增效作用。温度对卵转铁蛋白的铁结合能力影响较大，60℃条件下处理仍能保持卵转铁蛋白的铁结合能力。此外，高的净电荷引起分子间强烈静电斥力，导致蛋白质分子结构充分展开，促使卵转铁蛋白环状结构打开，暴露出铁结合样点，利于卵转铁蛋白结合带正电荷的Fe3+[18]。试验结果显示：pH 8.0时，卵转铁蛋白结合能力较高，与理论相吻合。综上，优化条件下，卵转铁蛋白的铁结合能力为91.5%。经原子吸收分光光度法测定螯合铁卵转铁蛋白样品的铁含量达到1.28μg/g，卵转铁蛋白的铁饱和度为89.2%，接近理论值。

图1 卵转铁蛋白铁结合能力的优化图Fig.1 Optimization of the iron-binding capacity of ovotransferrin

2.2 不同干燥条件下螯合铁卵转铁蛋白的理化性质

缺铁卵转铁蛋白干燥后为白色絮状固体，经螯合后含铁卵转铁蛋白为粉红色絮状固体，溶解性进一步提升。

用傅里叶红外光谱分析两种常规的处理工艺对螯合铁卵转铁蛋白的影响，结果（图2）显示两种干燥方式获得的卵转铁蛋白粉峰型完全重合，表明干燥方式对卵转铁蛋白铁结构无影响。

表1中色度分析结果显示，冷冻干燥与喷雾干燥获得的卵转铁蛋白之间存在极显著差异，其色度L值分别为77.0和90.6。冷冻干燥处理后的卵转铁蛋白颜色呈橘粉色，而喷雾干燥的为淡粉色。

图2 不同干燥条件卵转铁蛋白的傅里叶红外图谱Fig.2 The FT-IR spectra of ovotransferrin by different kinds of drying methods

表1 不同干燥条件卵转铁蛋白的色度Table1 Chromaticity color of ovotransferrin by different kinds of drying methods

表2显示：冷冻干燥与喷雾干燥获得的卵转铁蛋白含水量分别为4.45%和5.77%，而水分活度分别为0.48和0.49，无明显差异。水分分布（数据未列出）表明喷雾干燥获得的卵转铁蛋白中水的分布状态有3种：一部分结合水占比42%，大部分亲和水占比52%。亲和水分为两种：亲和较强的占比28%，亲和较弱的占比24%，还含有少量的自由水占比6%。而冷冻干燥获得的卵转铁蛋白中水的分布状态有两种：少部分结合水占比9%，绝大部分分布在亲和水部分，占比91%。粒径分析结果D[3，2]和D[4，3]均存在极显著性差异。冷冻干燥获得的卵转铁蛋白的D[3，2]为17.7μm，D[4，3]为93.8μm，而喷雾干燥获得的卵转铁蛋白的D[3，2]为4.6μm，D[4，3]为22.3μm，冷冻干燥获得的卵转铁蛋白的平均粒径显著高于喷雾干燥的。然而，粉体粒径越小粉体间越容易吸附，流动性越差。流动性过小粉体容易产生粘附，对加工成片剂十分不便。冷冻干燥获得的卵转铁蛋白流动性明显强于喷雾干燥，表明冷冻干燥的卵转铁蛋白具有更好的成片性，有利于加工成片剂。冷冻干燥的卵转铁蛋白完全溶解时间为77 s，喷雾干燥的卵转铁蛋白的完全溶解时间为91 s，冷冻干燥获得的卵转铁蛋白相对喷雾干燥更易溶于水，有更快的溶解速率。

表2 卵转铁蛋白的理化性质Table2 Physicochemical properties of ovotransferrin products

2.3 螯合铁卵转铁蛋白的微观结构

利用扫描电镜分别观察冷冻干燥卵转铁蛋白与喷雾干燥卵转铁蛋白的微观结构，发现200倍数下可以观察到喷雾干燥的卵转铁蛋白较细小，小部分粉体聚集。而冷冻干燥的卵转铁蛋白呈大小不一的片状结构，颗粒相对喷雾干燥较大，此结果与粒径分布仪数据一致。冷冻干燥获得的卵转铁蛋白呈较大的片状，这可能是由于冷冻干燥的卵转铁蛋白收集过程是通过碾压获得，所以粉体大小不一。

图3 螯合铁卵转铁蛋白的扫描电镜图Fig.3 SEM image of ovotransferrin products

2.4 螯合铁卵转铁蛋白对大鼠体重及脏器指数的影响

补铁后大鼠平均体重和各脏器指数如表3所示。补铁结束后，所有试验组的大鼠体重均明显高于F组（P＜0.01），说明缺铁对大鼠体重的增长有延缓作用。30 d时，增重率最高的为B组（41.8%），其次是正常组（40.3%）。大鼠服用螯合铁卵转铁蛋白补铁30 d后，体重增长率趋向正常水平，相对阳性对照，硫酸亚铁补铁组未出现不良反应。肝脏、脾脏是机体最主要的铁储存器官，在机体内铁主要以铁蛋白和含铁血黄素形式存在于肝脏和脾脏中。由表3可以发现补铁后，冷冻干燥卵转铁蛋白和喷雾干燥卵转铁蛋白的肝脏指数与缺铁组有显著性差异（P＜0.01），说明这两种铁源可能更有利于大鼠肝脏组织的生长、发育和更新。对于脾脏指数，两组间没有显著性差异（P＞0.05）。

表3 螯合铁卵转铁蛋白对缺铁性贫血大鼠体重及脏器指数的影响Table3 Effect of ovotransferrin products on body weight and organ indexes of iron-deficiency anemia rats

2.5 螯合铁卵转铁蛋白对大鼠血常规的影响

测试各组大鼠血常规的7个指标，分别是红细胞计数（RBC）、血红蛋白浓度（Hb）、血细胞压积（HCT）、红细胞分布宽度（RDW）、红细胞平均血红蛋白量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞平均体积（MCV）。红细胞计数，是指单位体积血液中所含的红细胞数目，对于提示累及红细胞系统的疾病有重要意义。由表4可知，给药前，除A组正常大鼠外，其余各组的血常规无显著性差异。30 d后，各组RBC值均显著高于F组（P＜0.01），且B，C组高于正常组大鼠。血红蛋白又称血色素，是红细胞的主要组成部分，能与氧结合，运输氧和二氧化碳。血红蛋白增高、降低的临床意义基本和红细胞计数的临床意义相似，血红蛋白能更好地反映贫血的程度。Hb、HCT、MCV实验结果显示，给药结束后各组均显著高于F组（P＜0.01），其中B组在30 d时的血红蛋白质量浓度达到163.47 g/L，C组达到171.39 g/L，增幅分别为136.1%和166.3%，略高于D组（117.5%）。血细胞压积结果显示B组和C组在30 d后分别恢复到43.67%和45.2%，与A组和D组差异不显著（P＜0.05）。

表4 螯合铁卵转铁蛋白对缺铁性贫血大鼠血常规（RBC、Hb、HCT、RDW）的影响Table4 Effect of ovotransferrin products on blood indexes（RBC，Hb，HCT，RDW）of iron-deficiency anemia rats

红细胞平均血红蛋白含量和红细胞平均体积下降，表现于小细胞低色素性贫血多为正常细胞性贫血，临床上多见于缺铁性贫血[19]。血红蛋白含量正常或偏高，提示体内铁质丰富，无需补铁。血红蛋白含量偏低，表示体内缺铁，进而影响血红蛋白的合成和携氧能力，造成贫血，阻碍身体各项生理活动的正常进行。表5显示螯合铁卵转铁蛋白对缺铁性贫血大鼠血常规（MCH、MCHC、MCV）的影响，在给药期内所有实验组大鼠的MCH值和MCV值均明显大于F组（P＜0.01），说明贫血大鼠对螯合铁卵转铁蛋白的生物利用度较高。综上所述，螯合铁卵转铁蛋白对血常规7个指标有显著的促进作用，经过30 d的给药处理，与正常大鼠的指标接近。

表5 螯合铁卵转铁蛋白对缺铁性贫血大鼠血常规（MCH、MCHC、MCV）的影响Table5 Effect of ovotransferrin products on blood indexes（MCH，MCHC，MCV）of iron-deficiency anemia rats

2.6 螯合铁卵转铁蛋白对大鼠血清指数的影响

测试卵转铁蛋白对缺铁性贫血大鼠血清指标的4个指标，分别是血清铁含量（SI）、血清铁蛋白含量（SF）、转铁蛋白含量（TRF）和铁总结合力（TIBC）。其中血清铁是人体的必需元素，具有生理活性的铁除以血浆的转铁蛋白形式存在外，主要以血红素的形式存在，因此，缺铁会引起贫血。血清铁蛋白是去铁蛋白和铁核心Fe3+形成的复合物[20]。铁蛋白的铁核心Fe3+具有强大的结合铁和贮备铁的能力，以维持体内铁的供应和血红蛋白相对稳定性[21]。SF是铁的贮存形式，其含量变化可作为判断是否缺铁或铁负荷过量的指标[22]。由表6可知，给药前，除A组正常大鼠外，其余各组的血清指标无显著性差异。30 d后，各组血清铁含量和血清铁蛋白含量均显著高于F组（P＜0.01），且B，C组的血清铁蛋白含量分别达到108.29 ng/mL和117.45 ng/mL，高于正常组大鼠。转铁蛋白含量的升高常见于缺铁性贫血和铁蛋白升高的情况，说明冷冻干燥卵转铁蛋白和喷雾干燥卵转铁蛋白及硫酸亚铁对缺铁性贫血大鼠有一定的治疗作用。B组与A组指标无显著性差异（P＜0.05），表明缺铁性贫血大鼠该指标已恢复到正常水平。血清总铁结合力（TIBC）是指血清中转铁蛋白能与铁结合的总量，反映血浆转铁蛋白的水平[23]。由于缺铁性贫血时机体缺铁，与铁结合的转铁蛋白比通常情况要少，所以未与铁结合的转铁蛋白增加导致TIBC升高。数据显示B组、C组和D组的TIBC值由0 d的164.38，158.41μmol/L和147.13μmol/L分别降至89.31，81.31μmol/L和78.31μmol/L，接近于正常组大鼠指标。综上所述，螯合铁卵转铁蛋白对贫血大鼠血清的4个指标均有显著的促进作用，30 d的给药处理后与正常大鼠的指标接近。

表6 卵转铁蛋白对缺铁性贫血大鼠血清指标的影响Table6 Effect of ovotransferrin products on serum indexes of iron-deficiency anemia rats

3 结论

缺铁性贫血是发展中国家比较普遍的一种功能型贫血，多发生在青少年和孕妇。天然纯化的卵转铁蛋白含铁量较低，经过条件优化可提高铁结合能力，满足缺铁大鼠对铁源的需要。临床上一直使用硫酸亚铁作为首选药物，副作用发生率高，稳定性差，易被氧化。卵转铁蛋白补铁剂的开发有望解决此类问题。本试验结果表明，冷冻干燥卵转铁蛋白与喷雾干燥卵转铁蛋白在色度、粒径分布、完全溶解时间等方面存在极显著的差异，而在水分活度和化学键结构上无明显差异。在大鼠服用螯合铁转铁蛋白补铁30 d后，体重增长率、血常规和血清指标趋向正常水平，相对阳性对照（硫酸亚铁补铁组）并未出现不良反应。综上所述，螯合铁卵转铁蛋白具有较好的治疗缺铁性贫血的作用。本结果有望为开发一种新型的治疗缺铁性贫血的补铁剂提供理论基础。