含中药动物血清干预退变椎间盘细胞的研究进展▲

唐少雄 吕友慧 宋 凯 杨利学

(1 陕西中医药大学第一临床医学院， 咸阳市 712000，电子邮箱:tangsx3@163.com;2 陕西中医药大学附属医院脊柱骨科，咸阳市 712000)

【提要】 目前实验研究已证实中医药防治椎间盘突出有确切疗效。运用含中药动物血清进行体外干预退变椎间盘细胞有效、可行，不仅克服伦理问题，还能够反映药物在体内真实状态，有助于深入探究中医药在防治椎间盘退变的作用机制。本文就含中药动物血清干预动物及人椎间盘细胞的研究进展进行综述。

椎间盘退变是引起颈部或腰背部疼痛的一种常见病因，影响人类健康及生活水平，严重时可造成高致残率和巨大的医疗成本。随着中国社会经济、医疗水平的不断提升，高龄老人越来越多，退变性椎间盘相关腰腿痛的发病率也越来越高[1-2]。中医药防治椎间盘退变的效果受到关注，并且获得大量动物实验的验证。然而，其作用机制仍未完全清楚，且动物实验研究的作用机制是否等同于临床作用机制，仍需在人体椎间盘细胞实验中进一步去证实。

含中药血清是指给动物服用一定量的药物，经过一段时间后采集血液，离心后所得到的血清[3-4]。利用含中药血清进行体外干预，可较为接近真实药物在体内产生药效的真实过程：药物原有成分在体内或转化为活性成分，或代谢后失活，或没有被吸收入体内，或通过第二信使间接发挥作用。这使得体外实验模拟了体内过程，达到了体外实验能够反映药物体内真实状态的目的[5-6]；克服了中药粗制剂直接加入反应体系中进行体外实验的缺点，能从一定程度上反映中药方剂复杂体系与生物机体的复杂生命系统的相互作用的规律。相比于直接以中药复方制剂干预的体外实验，制备含中药血清进行的体外研究，其结果更具科学和可信度[7-8]。本文就含中药动物血清干预退变椎间盘细胞的研究进展做一综述。

1 椎间盘退变机制

椎间盘是相邻两个椎体间独特的组织，其包含外层和中央部，前者为富含弹性的Ⅰ型胶原蛋白纤维环，后者为富含Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖的髓核和软骨终板[9]。椎间盘的退变与椎间盘细胞胶原蛋白合成减少、椎间盘蛋白聚糖降解增强、髓核细胞的减少均有着密切的关系[10-12]。在椎间盘退变各结构破坏改变中，最突出的是环撕裂、椎间盘脱出、终板损伤、椎管狭窄和椎骨内骨赘形成。单次冲击、周期性和连续载荷、弯曲、轴向旋转以及复杂的载荷机制等均影响椎间盘结构。但是，长期负重对脊椎的破坏更大，严重的后果包括代谢酶和生长因子的失衡、椎间盘应力分布的改变以及机械刚度的降低，从而导致脊柱生物力学受损。这一点也得到Vergroesen等[13]的研究结果的支持，其认为力学和生物学都是椎间盘退变的主要原因，且两者相互联系、相互放大。这种观点也得到了越来越多的认可，即细胞生理受到机械负荷的强烈影响。Vergroesen等[13]同时提出，机械过载会导致分解代谢细胞反应和水结合细胞外基质变性的恶性循环。这不仅说明了椎间盘退变的复杂性，也解决了该领域的一些争议，因为椎间盘的退变可以在任何时候进入恶性循环，最终导致相同的病理。

2 椎间盘退变的特征以及含中药动物血清体外干预动物退变椎间盘细胞

相关学者通过动物实验模型模拟人椎间盘退变过程，间接观察人椎间盘退变特征。例如，Choi等[14]建立的SM/J模型小鼠品系概括了人类椎间盘退变的许多显著特征，其退化过程的特征包括：(1)髓核细胞减少，椎间盘蛋白聚糖基质稳态发生紊乱，而椎间盘蛋白聚糖基质稳态失衡和损失更加速了椎间盘细胞衰老。无论是体内实验还是体外实验，椎间盘蛋白聚糖的快速丧失都能加速椎间盘细胞衰老[2]。(2)髓核与纤维环或终板软骨之间的区别消失。(3)髓核和纤维环表现出较高的组织学等级。(4)聚集蛋白聚糖的作用显著。(4)髓核中胶原蛋白X和基质金属蛋白酶13的异常表达，以及软骨细胞肥大的标志物Ⅹ型胶原蛋白α1、结缔组织生长因子和Runx2的表达升高。(6)髓核细胞促进营养不良矿化。(7)椎间盘变硬，高度降低，椎骨质量变差。

研究表明，对动物退变椎间盘细胞进行含中药血清体外干预是可行的，可直观地了解到经过含中药血清干预后椎间盘细胞形态学、病理学方面的改变[15-17]。牛凯等[18]运用含桃仁-红花血清干预白细胞介素(interleukin)-1β诱导的大鼠退变椎间盘细胞，结果发现含中药血清可抑制大鼠椎间盘软骨终板细胞凋亡，并促进软骨终板细胞的增殖，上调软骨蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白α1和SOX9 mRNA表达，下调Ⅹ型胶原蛋白α1和IL-6 mRNA的表达。徐无忌等[19-20]、吴国华等[21]应用含六味地黄丸血清对兔椎间盘体外退变模型细胞进行干预， 发现其可以延缓兔椎间盘体外退变模型细胞外基质中糖胺多糖、硫酸软骨素/硫酸角质素比值、透明质酸含量的降低程度，上调髓核细胞JNK及P38通路的mRNA含量及蛋白表达量，从而在一定程度上可以延缓椎间盘细胞的退变；同时其可降低椎间盘胶原蛋白总体含量下降速率，改善椎间盘内环境，从而减慢椎间盘退变进程，达到保护椎间盘的作用。以上研究表明，含中药血清可通过抑制细胞凋亡、调节相关成骨因子或软骨相关因子、细胞外基质成分等途径，延缓椎间盘细胞的退变。这为含中药血清干预人体退变椎间盘细胞奠定了一定的基础。

3 含中药动物血清干预人退变椎间盘细胞

3.1 含中药动物血清干预人退变椎间盘细胞的可行性 应用含中药动物血清干预人体细胞组织的体外实验研究，可以有效地解决直接在人体实验的伦理问题，并且可以在体外直观观察并检测各类干预性指标。 有学者采用大鼠或家兔制备含中药血清，成功干预人体肾小管上皮细胞、肝细胞、单核细胞、软骨细胞[22-26]。应用动物含中药血清成功干预人体不同组织细胞，为含中药动物血清体外干预人体其他细胞开辟了新途径，也为探索中医药治疗疾病的现代机制打下了坚实的基础。

3.2 含中药动物血清干预人退变椎间盘细胞 随着研究的深入，提取含中药动物血清干预人体椎间盘组织也有了突破[27]。周红海等[28]给大鼠灌胃益气活血方后提取其含中药血清作为药源，对体外培养的人退变椎间盘髓核细胞进行干预，结果显示，益气活血方血清可上调非破裂型腰椎间盘突出退变髓核细胞中聚蛋白多糖 mRNA的表达，促进ColⅡ的合成，恢复椎间盘的刚性支撑框架，并可促进蛋白多糖的合成，增加与水的结合，对抗压力，分散和吸收负荷，从而改善非破裂型突出腰椎间盘的组织结构和力学特性。陈江等[29]给新西兰兔灌胃身痛逐瘀汤后提取含中药血清作为药源，发现身痛逐瘀汤血清对人退变髓核细胞活力、形态及超微结构具有保护作用，推测其可能通过上调磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路的表达延缓人髓核细胞凋亡，从而延缓椎间盘退变。周文明等[30]给大鼠灌胃补肾壮督方后提取含中药血清作为药源，对人髓核细胞退变模型进行体外干预，结果显示，补肾壮督方血清可有效抑制髓核细胞凋亡，其可能通过减少B细胞淋巴瘤2相关X蛋白、凋亡酶激活因子1、细胞色素C的蛋白及mRNA表达，增加B淋巴细胞瘤-2蛋白表达，从而减少线粒体信号通路所导致的髓核细胞凋亡，改善椎间盘退变。以上实验研究表明，中药复方在人体内可能通过抑制椎间盘细胞凋亡、调节相关胶原蛋白及基因的表达、改善椎间盘微结构，从而达到延缓椎间盘退变。

4 小 结

应用含中药动物血清进行中药药效作用的观察、研究，能更好地反映药物在体内环境中产生药效的真实过程，在理论上更具有科学性与真实性，有利于从细胞分子水平上探讨中药的作用机理。含中药动物血清替代人血清体外干预人体细胞的成功，转换了以往完全脱离人体的动物实验，进而可以在体外直观地观察人体细胞在中药干预下的变化过程，使实验研究更加贴近药物在人体的药效反应过程，运用含中药动物血清干预人退变椎间盘细胞，克服了不能直接提取口服中药后的人体血清及人退变椎间盘组织进行实验研究的伦理学问题，观察到的结果更接近中药在人体中的作用结果。因此，运用含中药动物血清进行体外干预退变椎间盘细胞是有效、可行的，可更加深入地探究中医药在防治椎间盘退变过程中的作用机制，为中医药临床治疗腰椎间盘突出症提供科学依据。而诸多的含中药动物血清体外细胞学实验研究表明，含中药血清可有效改善、延缓椎间盘细胞退变。其可能通过抑制椎间盘细胞的凋亡、抑制椎间盘胶原蛋白含量下降、增加椎间盘胶原蛋白的表达、保护椎间盘细胞超微结构、维持椎间盘蛋白聚糖基质稳态等方面防治椎间盘退变。