补充肌醇对不育男性精子质量的影响

张国忠，郑杰，胡艳梅，伍学一，谢萍，杨宗富

据估计，约7%的不育男性是由于精索静脉曲张、隐睾和性腺功能减退等生殖系统疾病导致的，其中25%～30%的患者为特发性不育症。当男性的精液参数低于世界卫生组织（WHO）出版的第五版《人类精液检查与处理实验室手册》推荐参考值时被认为患有男性因素不育症，典型的参数变化是精子浓度降低（少精子症）、精子活力变差（弱精子症）和精子形态异常（畸形精子症）。而约25%～87%的男性不育是由于氧化应激引起精子损伤造成的[1]。氧化应激是精子脂质过氧化（lipid peroxidation，LPO）、DNA损伤和细胞凋亡的潜在危险因素，可影响男性的精液质量和生育能力[2]。抗氧化剂疗法是目前治疗少、弱精子症应用较为广泛的方法，肌醇（inositol）则是典型的抗氧化剂。现对肌醇作为抗氧化剂治疗不育男性的作用机制、体内和体外研究进展进行综述。

1 活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）水平变化对精子质量的影响

在雄性生殖细胞发育的早期阶段，精子细胞就能够产生少量的ROS，是精液中ROS的主要来源于之一。主要有两种产生途径：第一种是通过细胞膜上的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）与底物反应产生，第二种是线粒体从呼吸链泄漏电子产生。在正常生理条件下，ROS参与精子染色质凝聚，通过诱导精原细胞凋亡或增殖来调节生殖细胞的数量。在成熟精子中，ROS在获能、顶体反应、线粒体鞘稳定性和精子运动中起重要作用。ROS还可以作为信号分子（细胞信号的第二信使）发挥作用。而白细胞是精液中ROS的第二个主要来源，在生理条件下，白细胞产生的活性氧是精子的1 000倍。白细胞产生的高水平的ROS在细胞防御感染和炎症机制中起着重要作用。但是当ROS的产生超过人体的抗氧化能力时，就会发生氧化应激，对精子产生不利影响，严重时导致男性不育[3]。研究发现，有生育能力的男性的精子具有高线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP），不育男性的精子具有较低的MMP和产生高水平的ROS[4]。蛋白质组学研究发现，当弱精子症患者的应激反应蛋白热休克蛋白A9（HSPA9）和抗氧化蛋白GSTMu3的表达水平下调时会导致氧化应激产物积聚，从而影响精子活力[5]。精液中的氧化平衡是影响精子质量的重要因素，研究发现特发性不育男性的精浆中一氧化氮（nitric oxide，NO）、8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxydesoxyguanosine，8-OHdG）水平高于正常生育男性，而总抗氧化力（total antioxidant capacity，TAC）水平低于正常生育男性，且NO和8-OHdG水平升高与精液体积、精子总数和形态呈负相关，而TAC与精子数量和形态呈正相关[6]。氧化平衡被破坏后，发生氧化应激，通过诱导精子DNA损伤，降低精子受精潜能，从而对精子功能产生负面影响。此外，与有生育能力的男性相比，不育男性的精浆抗氧化能力较低，当ROS水平较高时会导致LPO增加[7]。

2 氧化应激对不育男性精子的影响

目前全球有10%～15%的夫妇无法正常生育，其中男性因素不育占一半以上，而氧化应激是引起男性不育的主要因素之一[8]。尽管在精子成熟、获能、超活化、顶体反应和精卵融合过程中均需要ROS，但ROS含量过高会损伤精子DNA、脂质和蛋白质，引起精子细胞凋亡，精子质量变差，从而导致男性不育[9]。线粒体是精子运动的关键细胞器[4]，是精子质量好坏及是否具备生育能力的生物学标志物，对精子的活力、获能、顶体反应和受精方面均具有重要意义[10]。精子的线粒体功能障碍与精浆氧化应激的发病机制有关，精浆氧化应激是导致许多“明显”特发性男性不育的关键因素[11]，产生过多的精子线粒体ROS会导致精子功能缺陷，例如弱精子症患者的精子运动能力低下[12]。在男性生殖系统中，有许多因子可以诱导精子线粒体产生ROS，引起一系列的氧化应激反应，持续对精子造成氧化损伤，从而影响精子的活力、精卵识别能力、顶体反应和精卵结合能力等方面的功能[13]。还可以通过诱导精子DNA损伤，降低精子的某些功能和受精潜能，影响胚胎的发育能力和子代健康[6]。抗氧化剂疗法被广泛用于改善弱精子症患者的精子活力[14]。一方面，抗氧化剂不仅能够减少机体内氧自由基的产生，减缓或防止氧化损伤，还能修复精子的损伤[15]。另一方面，抗氧化剂能够抑制精子中的脂氧合酶活性，保护精子免受暴露于外源性过氧化氢产生的氧化应激[16]。研究认为口服抗氧化剂可以通过减少氧化损伤来改善精子质量，提高不育男性接受辅助生殖助孕时的临床妊娠率和活产率[17]。

3 肌醇改善精子质量的作用机制

肌醇是磷脂（phosphatidylinositol，PI）和磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol phosphates，PIPs）生物合成的前体，其还参与水溶性肌醇磷酸酯（inositol phosphates，IPs）的合成。PI与内质网中的磷脂多糖结合形成糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinosito，GPI）锚定物，将许多蛋白质与质膜结合，形成肌醇磷脂多糖（inositol phosphoglycans，IPG）、肌醇醚酯等其他衍生物[18]。肌醇及其衍生物参与了与细胞膜上的蛋白质结合、细胞信号传导和体液运输、刺激细胞膜的兴奋性、调节离子通道开放、细胞内钙离子信号传导、细胞骨架形成和染色质重组、基因组和表观遗传调控等生物学过程[19-20]。在男性生殖系统中，肌醇主要由卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）调节的支持细胞产生[21]。已有研究证明肌醇及其衍生物参与男性射精后精子的运动、精子诱导、精子获能、顶体反应及与卵母细胞膜相互识别等的一系列复杂受精过程。目前调节精子前向运动的信号通路尚未完全阐明，但有研究报道认为磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）信号通路参与精子前向运动的调节[22]，且将PIP2转化为PIP3的信号通路是其中参与者之一[23]。精子诱导是一种趋热机制，通过这种机制，温度刺激激活其调节信号转导途径，使PIP2水解为IP3和二酰甘油（DAG），接着IP3与细胞内的Ca2+受体结合，释放Ca2+，从而改变精子的运动方向[24]。精子“脂筏”中的GPI锚定蛋白的释放被认为是精子受精能力发育的关键步骤，而肌醇及其衍生物在精子获能时信号分子复合体“脂筏”重新分布转导信号通路，以及肌动蛋白参与的细胞骨架重组等变化过程中发挥着关键作用[25]。此外，PIP2合成减少可抑制肌动蛋白聚合和精子运动，而PIP2合成增加则可增强两者的活性；在精子获能过程中，丝状肌动蛋白和PIP2结合物的增加可导致肌动耦联胶溶蛋白失活[26]。1，4，5-三磷酸（肌醇）可调节钙离子通道的开放，使细胞外钙离子内流，引起精子顶体反应[27]。Fu等[28]研究结果表明肌醇六磷酸激酶1（inositol hexakisphosphate kinase-1，IP6K1）的缺失会引起圆形生殖细胞脱落、精原细胞发育停滞和畸形增多、顶体变性、生殖细胞-支持细胞相互作用缺陷和精子发育失败等一系列变化，导致精子细胞被支持细胞吞噬，最终附睾中没有生成精子。

4 体内补充肌醇对不育男性精子质量的影响

弱精子症是指男性的精子活力差，是导致男性不育的主要因素之一。精子的活力可以通过减少高温环境暴露、改善不健康的生活习惯（包括缺乏运动、过度疲劳），以及降低内分泌和心血管有关疾病的发生风险等干预措施来改善，主要原理为减少氧化应激对精子的损伤。另外，研究表明男性可通过减少吸烟和饮酒来改善精子活力[29]，内科医生则认为肥胖男性通过减肥和定期锻炼有助于改善性功能，提高精液标本的精子活力。此外，增加性交频次和射精次数也可以改善精子的活力[30]。同样通过外科手术（如精索静脉曲张）、使用皮质类固醇治疗生殖道慢性炎症后减少抗精子抗体，以及使用抗生素治疗生殖道感染等方法都可以用于改善因氧化应激导致的精液质量。尽管治疗弱精子症的理想疗法尚未确立，但学者们一直在寻找合适的抗氧化剂疗法[31]。越来越多的研究结果支持肌醇在人类生殖中的作用，且人类每天补充肌醇的剂量不超过4 g是安全的，最佳给药方法是每天2次，每次2 g[32]。

研究发现使用肌醇、α-硫辛酸、叶酸、甜菜碱和维生素等联合治疗不育男性90 d后，患者的精液质量得到改善，精子浓度、精子总数、精子活率、活动精子总数和正常形态率均显著提高[1]。采用肌醇联合矿物质和维生素治疗弱精子症患者，结果有85.32%的患者的精子活力有明显改善，34.86%的患者恢复了正常的精子活力，但有12.84%的患者无任何益处，表明补充肌醇可以显著改善精子活力，从而增加自然受孕的可能性[33]。在体外受精（in vitro fertilization，IVF）周期中使用肌醇联合叶酸治疗弱精子症患者，可显著改善弱精子症患者的精液质量[34]。当然，单独使用肌醇治疗不育男性也能达到相同的效果。Calogero等[35]研究发现补充肌醇可以降低特发性不育症患者的FSH和黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）水平，升高抑制素B水平，同时，精子浓度、精子计数和活率显著改善。同样地，使用肌醇治疗代谢综合征的弱精子症患者发现，补充肌醇后患者的体质量指数（body mass index，BMI）、腰围（waist circumference，WC）和三酰甘油（TG）水平没有显著变化，但稳态模型评估的胰岛素抵抗指数（homeostatic model assessment for insulin resistance，HOMA）指数有所下降，并伴随着雌二醇（estradiol，E2）和性激素结合球蛋白（sex hormonebinding globulin，SHBG）水平的下降，而精子浓度、活率和形态均显著增加及改善[36]。Capece等[37]研究中使用肌醇治疗少弱畸精症患者，表明补充肌醇显著增加了精子浓度和活率，降低精子DNA碎片率，但精子活力、总活动率、正常形态率以及LH、FSH和睾酮水平没有变化。

5 体外精子制备过程中添加肌醇对不育男性精子质量的影响

体外精液制备技术中补充肌醇，能显著降低ROS水平，是治疗男性不育的有效策略。少弱畸精症患者的精子被无定形纤维化所覆盖，研究表明，使用肌醇与精子共孵育可减少无定形纤维化的出现[38]，调节精液的渗透特性，降低精液标本的黏稠度。同样地，Scarselli等[39]分别将精索静脉曲张患者的正常黏稠度弱精子症患者精液标本和没有任何睾丸病变的高黏稠度弱精子症患者精液标本与肌醇在37 ℃孵育15 min，发现与肌醇孵育提高了高黏稠度弱精子症患者精液标本精子活率，而精索静脉曲张患者的精液标本的精子活率无明显改善。Condorelli等[40]将20份正常精液标本和20份少弱畸精子症患者的精液标本分别与2 mg/mL的肌醇体外孵育2 h，发现精子参数正常和异常患者的精子活力和回收的精子数量均显著增加，MMP高的精子数比例增加。生育力正常男性的精液标本中具有更多的高MMP的精子，MMP与精子的运动能力有关，而线粒体功能障碍可能是发生特发性弱精子症的根本原因[4]。一项前瞻性双中心随机试验结果表明在精液制备过程中添加肌醇可以提高胞浆内单精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）周期的受精率和第3天胚胎的质量[41]。Artini等[42]同样使用肌醇对精液正常男性和少弱畸精症患者的精液标本进行体外孵育，结果表明肌醇可改善IVF周期的男性患者精子的前向运动能力。最近的一项关于37例接受宫腔内人工授精（intrauterine insemination，IUI）治疗的少弱精子症患者的研究，将少弱精子症患者随机分为2组，病例组给予0.5 mL（浓度为2 mg/mL）肌醇37 ℃孵箱孵育2 h，对照组不干预，结果表明肌醇处理显著提高了少弱精子症患者的精子活力[43]。

一项系统性回顾和荟萃分析结果表明，在精子冷冻-解冻过程中添加抗氧化剂同样可以提高精子的活动率和存活率，减少精子DNA断裂（sperm DNA fragmentation，SDF）和过氧化氢（H2O2）的产生，但解冻后精子的总活力没有明显改善[44]。在精液冷冻-解冻过程中，冷冻保存介质与左旋肉碱（l-carnitine，LC）联合使用可以显著改善弱精子症和正常精子标本解冻后的快速前向运动精子数、前向运动精子数、总活力和存活率[45]。在不育男性精液冷冻保存过程中补充肌醇，精液解冻后精子质量同样得到显著改善，对辅助生殖技术中的冷冻精子保存有重要的作用[46]。Mohammadi等[47]研究结果表明添加肌醇不仅可以改善冷冻-解冻精液的精子参数，还可以保护精子免受DNA损伤和细胞凋亡的影响。Abdolsamadi等[48]在少弱畸精子症患者精液冷冻-解冻过程中添加肌醇，发现能够改善精子的总活率和前向运动精子活力，降低精子DNA碎片率，但对ROS水平无显著影响。

6 结语

体内和体外研究结果表明补充肌醇可以降低氧化应激对不育男性的精子质量和生育能力的影响，改善不育男性的精液参数，降低精子DNA碎片率。但是目前检索到的关于肌醇在不育男性中的补充均为单中心、小样本的研究报道。且研究设计大部分为只是体内补充的研究，或只是体外补充的研究。目前，只有Korosi等[49]研究报道在IVF-ICSI助孕周期中结合体内和体外同时补充肌醇对精子质量的影响。在今后的研究中需进一步研究肌醇在精子生理学中的作用和潜在的分子机制。研究人群应有非常严格的纳入和排除标准，应进一步分析不育男性患者的年龄、BMI、生活习惯、相关疾病和脂肪分布等因素对研究结果的干扰。